Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.
Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.
एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी किया गया है, और हो सकता है, ligand रिसेप्टर बातचीत की प्रकृति को समझने के लिए एक अत्यंत शक्तिशाली तकनीक के लिए जारी रहेगा। परमाणु विस्तार में इन मुलाकातों visualizing, न केवल यह संभव कई जैविक प्रक्रियाओं गवर्निंग आणविक तंत्र का खुलासा करने के लिए है, लेकिन यह भी सीधे चिकित्सीय लाभ के लिए संपर्क इंटरफेस को बदलने के लिए संभव है। ऐसी सतह plasmon गूंज और इज़ोटेर्माल अनुमापन उष्मामिति (नाम करने के लिए सिर्फ एक जोड़ी) के रूप में तकनीक के साथ युग्मित, इस तरह के संशोधन तो बंधन आत्मीयता, बातचीत के कैनेटीक्स, और ऊष्मा पर सीधा प्रभाव का आकलन करने के biophysically का विश्लेषण किया जा सकता है। अंत में, प्रासंगिक प्रकार की कोशिकाओं पर कार्यात्मक प्रयोगों प्रदर्शन करके, रिसेप्टर ligand बातचीत करने के लिए संशोधन की आणविक और कार्यात्मक प्रभाव की एक विस्तृत चित्र बटोरा जा सकता है, बहुत विशिष्ट यंत्रवत जानकारी प्रदान करते हैं। कुल मिलाकर, तरीकों के इन प्रकार रोकते सक्षम करने के लिए एक परमाणु संकल्प चित्र प्रदान कैसे जैविक प्रणालियों काम करते हैं, निदान और उपचार के अग्रिमों के लिए परिचर प्रभाव के साथ की mination।
हमारी प्रयोगशाला नियमित रूप रिसेप्टर्स कि रोगज़नक़ों और कैंसर के लिए मानव टी सेल प्रतिरक्षा में मध्यस्थता, autoimmunity में अध्ययन करने के लिए इन तकनीकों का उपयोग करता है, और प्रत्यारोपण के दौरान। यहाँ, हम कैंसर के लिए मानव सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रिया, टी सेल रिसेप्टर (TCR) और मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (एचएलए) -restricted ट्यूमर व्युत्पन्न पेप्टाइड्स (Phla) के बीच एक संवाद द्वारा मध्यस्थता पर ध्यान केंद्रित। यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि हालांकि सीडी 8 + टी कोशिकाओं के कैंसर की कोशिकाओं को लक्षित कर रहे हैं, हम और दूसरों को पहले से पता चला है कि विरोधी कैंसर TCRs suboptimally उनकी आत्मीय Phla 1, 2 करने के लिए बाध्य है। इस प्रकार, कई प्रयोगशालाओं में परिवर्तन करने का प्रयास किया तो TCR 3, 4, 5 या पेप्टाइड ligand 6,वर्ग = "xref"> 7, 8 आदेश प्रतिरक्षाजनकता को बढ़ाने के लिए और बेहतर लक्ष्य कैंसर की कोशिकाओं को। हालांकि, इन तरीकों हमेशा प्रभावी नहीं हैं और बंद लक्ष्य विषाक्तता 4, 9, 10 सहित गंभीर साइड इफेक्ट, हो सकता है। इसके अलावा अनुसंधान आणविक तंत्र है कि कैंसर एंटीजन की टी-सेल मान्यता शासन की खोज के इन खामियों को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण होगा।
वर्तमान अध्ययन में, हम ग्लाइकोप्रोटीन 100 (gp100) सीडी 8 + टी कोशिकाओं भेदभाव मेलानोसाईट प्रतिजन का एक टुकड़ा के लिए विशिष्ट द्वारा ऑटोलॉगस मेलेनोमा कोशिकाओं के खिलाफ प्रतिक्रियाएं, gp100 280-288, द्वारा एचएलए-ए * 0201 (सबसे अधिक प्रस्तुत करने पर ध्यान केंद्रित -expressed मानव Phla वर्ग मैं)। इस प्रतिजन मेलेनोमा प्रतिरक्षा चिकित्सा के लिए एक व्यापक रूप से अध्ययन लक्ष्य दिया गया है और एक तथाकथित "heteroclitic" पेप्टाइड जिसमें एक valine alanine की जगह के रूप में विकसित किया गया हैलंगर स्थिति 9 में Phla स्थिरता 11 में सुधार होगा। यह दृष्टिकोण इन विट्रो में मेलेनोमा प्रतिक्रियाशील CTLs की प्रेरण को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया था और सफलतापूर्वक क्लिनिकल परीक्षण 12 में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, पेप्टाइड अवशेषों को संशोधनों के टी सेल विशिष्टता, क्लिनिक 6, 13 में सबसे heterolitic पेप्टाइड्स के गरीब प्रभावकारिता द्वारा प्रदर्शन पर अप्रत्याशित प्रभाव हो सकता है। दरअसल, gp100 280-288 का एक और heteroclitic रूप है, जो पेप्टाइड अवशेषों में Glu3 अला के लिए प्रतिस्थापित किया गया था, gp100 280-288 विशिष्ट टी कोशिकाओं 14, 15 के एक पॉलीक्लोनल आबादी द्वारा मान्यता निराकृत। हम पहले से दिखा दिया है कि पेप्टाइड लंगर अवशेषों में भी मामूली बदलाव काफी अप्रत्याशित तरीके 6, 16 में टी सेल मान्यता बदल सकते हैं। इस प्रकार, अध्ययन के निर्माण पर ध्यान केंद्रितकैसे सीडी 8 + टी कोशिकाओं को पहचान TCRs और Phla के बीच बातचीत का gp100 और कैसे संशोधनों की एक अधिक विस्तृत चित्र आईएनजी इस समारोह को प्रभावित कर सकता है।
यहाँ, हम gp100 280-288 एचएलए-ए * 0201 (A2-YLE) द्वारा प्रस्तुत करने के लिए विशिष्ट दो TCRs की अत्यधिक शुद्ध, घुलनशील रूपों, साथ ही Phla के प्राकृतिक और बदल रूपों उत्पन्न। इन अभिकर्मकों A2-YLE की heteroclitic रूप है, साथ ही साथ unligated रूप में उत्परिवर्ती pHLAs से दो के साथ परिसर में एक मानव TCR की त्रिगुट परमाणु संरचना का समाधान करने के लिए प्रोटीन क्रिस्टल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया। हम तो biophysical प्रयोगों में गहराई प्रदर्शन से TCRs पर पेप्टाइड प्रतिस्थापन के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए एक पेप्टाइड स्कैनिंग दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया। अंत में, हम एक आनुवंशिक रूप से संशोधित सीडी 8 + टी सेल लाइन उत्पन्न, ताकि विभिन्न पेप्टाइड संशोधनों के जैविक प्रभाव का परीक्षण करने के लिए कार्यात्मक प्रयोगों प्रदर्शन करने में A2-YLE विशेष TCRs में से एक व्यक्त करने के लिए, फिर से प्रोग्राम। ये आंकड़े दर्शाते हैं कि मोदीfications अवशेषों कि TCR बाध्यकारी मूल भाव के बाहर हैं पेप्टाइड अप्रत्याशित तोड़े पर आसन्न पेप्टाइड अवशेषों कि TCR बंधन और टी सेल मान्यता रद्द पर प्रभाव पड़ सकता है। हमारा निष्कर्ष मेलेनोमा के लिए इस महत्वपूर्ण चिकित्सीय लक्ष्य के टी सेल मान्यता अंतर्निहित संरचनात्मक तंत्र का पहला उदाहरण प्रतिनिधित्व करते हैं।
प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित किसी भी मानव रोग के संदर्भ में टी सेल प्रतिक्रिया की आणविक और सेलुलर विच्छेदन के लिए एक रूपरेखा प्रदान करते हैं। हालांकि कैंसर इस अध्ययन का मुख्य फोकस था, हम बहुत समान दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है वायरस 32, 33, 34, 35, टी सेल प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए 36, 37 और autoimmunity 38, 39, 40 के दौरान। इसके अलावा, हम इन तकनीकों का इस्तेमाल किया है और अधिक मोटे तौर पर आणविक सिद्धांत है कि टी सेल प्रतिजन मान्यता 2, 19, 41, 42 पर शासन को समझते हैं। दरअसल, संशोधनों की अप्रत्याशित प्रकृति के अवशेष पेप्टाइड, यहां तक कि उनTCR संपर्क अवशेषों के बाहर के प्रभावों टी सेल मान्यता heteroclitic पेप्टाइड्स के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। इन निष्कर्षों को सीधे बढ़ाया निदान 45, 46, 47 के रूप में उपन्यास टी सेल उपचारों के विकास के लिए योगदान दिया है, पेप्टाइड टीके 6, 43 और कृत्रिम उच्च आत्मीयता TCRs 3, 4, 5, 20, 44 सहित, के रूप में अच्छी तरह से।
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
एक अत्यधिक शुद्ध, कार्यात्मक प्रोटीन की पीढ़ी के तरीकों इस पत्र में उल्लिखित सभी के लिए आवश्यक है।
संशोधन और समस्या निवारण
अत्यधिक शुद्ध प्रोटीन पैदा करने में कठिनाइयाँ अक्सर अत्यधिक की अभिव्यक्ति से संबंधित-शुद्ध, ई कोलाई अभिव्यक्ति प्रणाली से अघुलनशील IBS। आमतौर पर, अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल (जैसे, विभिन्न ऑप्टिकल घनत्व में उत्प्रेरण अलग ई कोलाई उपभेदों का उपयोग कर, या विभिन्न मीडिया संरचनाओं का उपयोग) को संशोधित करने के लिए इन मुद्दों को हल करता है।
तकनीक की सीमाएं
इन तकनीकों में घुलनशील प्रोटीन अणुओं (TCR और Phla) है कि सामान्य रूप से कोशिका की सतह पर व्यक्त कर रहे हैं का उपयोग करें। इस प्रकार, यह सुनिश्चित करना है कि संरचनात्मक / biophysical निष्कर्षों सेलुलर दृष्टिकोण जैविक महत्व की पुष्टि करने के साथ संगत कर रहे हैं महत्वपूर्ण है।
मौजूदा / वैकल्पिक तरीकों के संबंध में तकनीक का महत्व
एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और कार्यात्मक विश्लेषण के माध्यम से पुष्टि बायोफिज़िक्स के उपयोग के माध्यम से, हम और दूसरों को दिखा दिया है कि कैंसर epitopes के लिए TCRs विशिष्ट आम तौर पर कम बाध्यकारी समानताएं 48 की विशेषता है। यह कम TCR समानता मदद मिल सकती है क्यों समझा टी कोशिकाओं की गिरफ्तारीई कैंसर समाशोधन पर स्वाभाविक रूप से प्रभावी नहीं। विरोधी कैंसर TCRs और आत्मीय ट्यूमर एंटीजन के बीच परिसरों के उच्च संकल्प परमाणु संरचना इस कमजोर आत्मीयता के लिए आणविक आधार प्रकट करने के लिए शुरू कर रहे हैं। इसके अलावा, इन अध्ययनों तंत्र है कि इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए डिज़ाइन उपचारात्मक उपायों आबाद का निर्धारण करने, भविष्य में सुधार 16 बोने के लिए सहायक होते हैं। इस अध्ययन में, हम एक gp100 एचएलए-ए * 0201-प्रतिबंधित मेलेनोमा मिलान के साथ परिसर में एक स्वाभाविक रूप से होने वाली αβTCR की पहली संरचना की जांच की। संरचना, एक में गहराई से biophysical परीक्षा के साथ संयुक्त, बातचीत का समग्र बंधन मोड का पता चला। हम यह भी एक अप्रत्याशित आणविक स्विच है, जो पेप्टाइड की एक उत्परिवर्तित रूप में हुई, कि TCR निराकृत बंधन और सीडी 8 + टी सेल मान्यता (कार्यात्मक प्रयोगों) (सतह plasmon अनुनाद का उपयोग मूल्यांकन) का पर्दाफाश किया। यह एचएलए प्रतिजन presentati की इस नई व्यवस्था प्रदर्शित करने के लिए ही संभव थावर्णित उच्च संकल्प के तरीकों के प्रयोग पर।
भविष्य अनुप्रयोगों या निर्देश के बाद इस तकनीक के माहिर
कुल मिलाकर, हमारे परिणाम एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और biophysical तरीकों की शक्ति जब मजबूत कार्यात्मक विश्लेषण के साथ संयुक्त प्रदर्शित करता है। इन तरीकों का उपयोग करना, यह सटीक आणविक तंत्र है कि टी सेल प्रतिजन मान्यता शासन काटना संभव है। वास्तव में, यह भी unligated TCRs की संरचना को हल करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए, प्रदर्शन कैसे गठनात्मक परिवर्तन प्रतिजन भेदभाव 49, 50, 51 के दौरान एक भूमिका निभा सकते हैं संभव है। अत्यधिक जटिल और गतिशील स्वभाव है कि underpins TCR-Phla बातचीत का एक बेहतर समझ भी चिकित्सा डिजाइन के लिए स्पष्ट संकेत है। सीधे अणुओं है कि उपचारात्मक को निशाना बनाया जा रहा है, साथ ही प्रभाव संशोधनों प्रतिजन recognitio पर है "देख" सक्षम होने के नातेn, स्पष्ट रूप से आगे जा रही इन दवाओं के विकास में सुधार होगा। इस अध्ययन में, हम बताते हैं कि एक भी पेप्टाइड अवशेषों में परिवर्तन किया गया है कि भारी एक TCR से लगे हुए नहीं उठते एचएलए बाध्य पेप्टाइड, जो, बारी में, नाटकीय रूप से टी सेल मान्यता बदल में अन्य अवशेषों के लिए संरचनात्मक परिवर्तन हस्तांतरित कर सकते हैं। टी सेल प्रतिजन मान्यता के दौरान कार्यरत आणविक तंत्र की एक और पूरी समझ बेहद लाभदायक है जब मानव रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए भविष्य उपचार डिजाइन किया जाएगा।
The authors have nothing to disclose.
बी.एम. एक कैंसर रिसर्च यूके पीएचडी छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है। एजी एक जीवन विज्ञान अनुसंधान नेटवर्क वेल्स पीएचडी छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है। वीबी एक कैंसर रिसर्च वेल्स पीएचडी छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है। DKC वेलकम ट्रस्ट रिसर्च कैरियर विकास फेलो (WT095767) है। अक्स वेलकम ट्रस्ट अन्वेषक है। GHM एक संयुक्त लाइफ साइंस रिसर्च नेटवर्क वेल्स और Tenovus कैंसर केयर पीएचडी द्वारा वित्त पोषित है। हम सुविधाओं और सहायता प्रदान करने के लिए डायमंड प्रकाश स्रोत पर कर्मचारियों को धन्यवाद।
S.O.C. media | Invitrogen |
Orbi-Safe New Orbit incubator | Sanyo |
carbenicillin | Sigma |
IPTG | Fisher |
Quick Coomassie Stain SafeStain | Generon |
Legend RT centrifuge | Sorvall |
Tris | Fisher |
magnesium chloride | Arcos |
NaCl | Fisher |
glycerol | Sigma-Aldrich |
Sonopuls HD 2070 | Bandelin |
DNAse | Fisher |
Triton | Sigma-Aldrich |
EDTA | Fisher |
guanidine | Fisher |
NanoDrop ND1000 | Thermo |
Peptides | Peptide Protein Research |
dithiothreitol | Sigma-Aldrich |
L-arginine | SAFC |
cysteamine | Fisher |
cystamine | Fisher |
dialysis tubing | Sigma-Aldrich |
urea | Sigma-Aldrich |
Metricel 0.45 μm membrane filter | Pall |
POROS 10/100 HQ | Applied biosystems |
ÄKTA pure FPLC system | GE Healthcare Life Sciences |
10 kDa MWCO Vivaspin 20 | Sartorius |
10 kDa MWCO Vivaspin 4 | Sartorius |
Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences |
Phosphate Buffer Saline | Oxoid |
BIAcore buffer HBS | GE Healthcare Life Sciences |
Biotinylation kit | Avidity |
BIAcore T200 | GE Healthcare Life Sciences |
CM5 chip coupling kit | GE Healthcare Life Sciences |
streptavidin | Sigma-Aldrich |
Microcal VP-ITC | GE Healthcare Life Sciences |
Hepes | Sigma-Aldrich |
Gryphon crystallisation robot | Art Robbins Instruments |
Intelli-plate | Art Robbins Instruments |
Crystallisation screens and reagents | Molecular Dimensions |
75 cm2 flask | Greiner Bio-One |
0.22 μm filters | Miller-GP, Millipore |
Ultra-Clear ultracentrifuge tube | Beckman Coulter |
Optima L-100 XP with SW28 rotor | Beckman Coulter |
CD8 microbeads | Miltenyi Biotec |
anti-CD3/CD28 Dynabeads | Invitrogen |
anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec |
CK medium, PHA | Alere Ltd |
anti-TCRVβ mAb | BD |
dasatinib | Axon |
MIP-1β and TNFα ELISA | R&D Systems |
51Cr | PerkinElmer |
1450 Microbeta counter | PerkinElmer |