Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.
Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.
X 선 결정학은 왔으며, 리간드 – 수용체 상호 작용의 성질을 이해하기 위해 매우 강력한 기술이 될 것. 원자 수준에서 이러한 상호 작용을 시각화함으로써뿐만 아니라 가능 다양한 생물학적 과정을 관리하는 분자 메커니즘을 밝히기 있지만 직접 치료 효과를위한 접촉 인터페이스를 변경하는 것도 가능하다. 이러한 표면 플라즈몬 공명과 (이름 단지 몇) 등온 적정 열량 측정법과 같은 기법을 결합 변형이어서 결합 친화력 상호 작용 동역학 및 열역학에 직접적인 영향을 평가할 biophysically 분석 될 수있다. 마지막으로, 중요한 세포 유형에서 기능 실험을 수행하여, 수용체 – 리간드 상호 작용에 대한 수정의 분자와 기능적 영향 상세한 그림이 매우 특정한 기계적인 정보를 제공하고, 얻을 수있다. 전반적으로, 이러한 종류의 방법 억제 유효화 원자 해상도의 화상을 제공 할 진단 및 치료의 발전을위한 부수적 인 의미와 함께 작동하는 방법을 생물학적 시스템의 mination.
우리 실험실에서 일상적으로자가 면역, 병원체, 암 인간 T 세포 매개 면역 수용체 공부 이러한 기술을 사용하여 이식시. 여기서, 우리는 T 세포 수용체 (TCR) 및 인간 백혈구 항원 (HLA) -restricted 종양 유래 펩티드 (pHLA) 사이의 상호 작용에 의해 매개되는 암 인간 CD8 + T 세포 반응에 초점을 맞춘다. CD8 + T 세포가 암 세포를 표적으로 할 수 있지만, 우리는 이전과 다른 항암 TCR도는 동족 suboptimally pHLA (1, 2)에 결합하는 것을 도시 한 때문에 중요하다. 따라서, 많은 실험실 변경 시도 어느 TCR 3, 4, 5 또는 펩티드 리간드 6면역 원성을 증가시키기 위해 더 좋은 표적 암세포 클래스 = "외부 참조"> (7, 8). 그러나, 이러한 접근은 항상 효과적이지 오프 타겟 독성 4, 9, 10과 같은 심각한 부작용을 가질 수있다. 암 항원의 T 세포 인식을 지배하는 분자 메커니즘을 탐구 또한 연구는 이러한 부족을 극복하는 것이 중요 할 것이다.
본 연구에서, 우리는 가장 일반적 * 0201 (HLA-A에 의해 제공 100 (gp100)을 당 단백질 분화 멜라닌 세포 항원의 단편에 특이적인 CD8 + T 세포에 의해자가 흑색 종 세포에 대한 반응, gp100 280-288에 집중 -expressed 인간 pHLA 클래스 I). 이 항원은 흑색 종의 면역 요법을 위해 널리 연구 대상이었다 및 발린이 알라닌으로 대체되는 소위 "헤테로 클리"펩티드 개발되었으며앵커 위치 9시 pHLA 안정성 (11)을 향상시킬 수 있습니다. 이 방법은 시험 관내에서 흑색 종의 CTL 반응의 유도를 향상시키는 데 사용하고, 성공적으로 임상 시험 (12)에 사용되어왔다. 그러나, 펩티드 잔기 변형 클리닉 6,13- 대부분 heterolitic 펩티드의 불량한 효능 입증 T 세포 특이성의 예측 효과를 가질 수있다. 사실, Glu3가 알라 치환 된 펩타이드 잔류 물에 gp100 280-288의 또 다른되어 헤테로 형태는, gp100 280-288 – 특정 T 세포 (14), (15)의 클론 집단에 의해 인정을 폐기. 우리는 이전에 펩타이드 앵커 잔류 물에 사소한 변화가 실질적으로 예측할 수없는 방법으로 6, 16 T 세포 인식을 변화시킬 수 있음을 증명하고있다. 따라서,이 연구는 빌드에 초점을 맞춘CD8 + T 세포의 TCR도 pHLA와 사이의 상호 작용의 gp100 어떻게 수정을 인식하는 방법의보다 상세한 그림을 보내고은이 기능에 영향을 미칠 수있다.
여기, 우리는 HLA-A * 0201 (A2-YLE)에 의해 제공 gp100 280-288에 대한 특정이 TCR도의 고순도, 수용성 형태뿐만 아니라 pHLA의 자연 및 변경 양식을 생성합니다. 이러한 시약은 헤테로 클리 A2-YLE 형태뿐만 아니라 unligated 형태 돌연변이 pHLAs 두 복잡한에서 인간 TCR의 삼원 원자 구조를 해결하기 위해 단백질 결정을 생성하기 위해 사용되었다. 그런 다음에 자세하게 생물 물리학 적 실험을 수행하여 TCR도에 치환 펩타이드의 효과를 입증하기 위해 펩티드 주사 방식을 사용 하였다. 마지막으로, 유전자 변형 CD8 + T 세포주를 생성하는 다양한 펩티드 변형의 생물학적 효과를 테스트하는 기능 실험을 수행하기 위해, A2-YLE 특정 TCR도 중 하나를 표현하는 재 – 프로그램. 이러한 데이터는도 MODI 입증fications 예측할 노크에 TCR 바인딩 및 T 세포 인식 폐지 인접 펩타이드 잔류에 영향을 미칠 수있는 TCR 결합 모티프의 외부에있는 잔류 물을 펩티드. 우리의 결과는 흑색이 중요한 치료 표적 T 세포 인식을 기본 구조 메커니즘의 제 1 예를 나타낸다.
여기에 설명 된 프로토콜은 인간 질병의 맥락에서 T 세포 반응의 분자 세포 절개하기위한 프레임 워크를 제공한다. 암 연구의 주요 초점했지만, 우리는 바이러스 32, 33, 34, 35에 대한 T 세포 반응을 조사하기 위해 매우 유사한 접근 방식을 사용하고 (36), (37) 및자가 면역 38, 39, 40 중. 더욱이, 우리는 T 세포 항원 인식 2, 19, 41, 42에 적용되는 분자 원리를 이해하기 더 넓게 이러한 기술을 사용했다. 실제로, 수정의 예측할 수없는 본질은, 심지어을 잔류 물을 펩티드TCR을 접촉 잔기의 외부에서 충격 T 세포 인식되어 헤테로 펩티드의 디자인을위한 중요한 의미를 갖는다. 이러한 결과는 직접적으로 개선 진단 프로그램 (45), (46), (47)뿐만 아니라, 펩타이드 백신 6 43 인공 고친 화성 TCR도 3, 4, 5, 20, 44을 포함한 신규 한 T 세포 치료법의 개발에 기여 하였다.
프로토콜 내에서 중요한 단계
고순도, 기능성 단백질의 생성은이 문서에 설명 된 방법 모두를위한 필수적이다.
수정 및 문제 해결
고순도의 단백질을 생성하는 어려움은 종종 매우의 발현과 관련순수한, 대장균 발현 시스템에서 불용성의 IB. 통상적으로, 발현 프로토콜 (예를 들어, 다양한 E. 콜라이 균주를 사용하는 상이한 광학 밀도에서 유도 또는 다른 매체를 사용하여 형성)를 수정하는 것은 이러한 문제를 해결한다.
기술의 한계
이러한 기술은 일반적으로 세포 표면에 발현되는 가용성 단백질 분자 (TCR 및 pHLA)를 사용한다. 따라서, 구조 / 생물 리 학적 결과는 생물학적 중요성을 확인하기 위해 셀룰러 방식과 일치하는 것을 보장하는 것이 중요하다.
기존의 / 대안적인 방법에 대한 기술의 중요성
X 선 결정학 및 기능 분석을 통해 입증 된 생물 물리학의 사용을 통해, 우리와 다른 암 항원에 대한 TCR도의 특정은 일반적으로 낮은 결합 친화도 (48)에 의해 특징 있음을 증명하고있다. 이 낮은 TCR 선호도는 T 세포가 아칸소 이유를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다전자 암을 취소에서 자연적으로 효과가 없습니다. 항암 TCR도하고 동족 종양 항원 간의 복합체의 고해상도 원자 구조는이 약한 선호도에 대한 분자 적 기초를 공개하기 시작했다. 또한, 이들 연구는 미래에 개선 (16)을 시드,이 문제를 극복하기위한 치료 적 개입을 기초 메커니즘을 결정하는 데 유용하다. 이 연구에서 우리는 gp100의 HLA-A * 0201 제한 흑색 종 항원 복잡한에 자연 발생 αβTCR의 첫 번째 구조를 조사 하였다. 에 대한 심도있는 생물 리 학적 검사와 결합 구조는, 상호 작용의 전체 바인딩 모드를 한 것으로 밝혀졌습니다. 또한 및 CD8 + T 세포 인식 (작용 성 실험) (표면 플라즈몬 공명을 이용하여 평가 된) 결합 TCR 폐기 펩티드의 변이 형태 발생 예기치 분자 스위치, 폭로. HLA 항원 presentati의 새로운 메커니즘을 입증하는 경우에만 가능했다기재된 고해상도 방법에 사용.
이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램이나 방향
강력한 기능 분석과 결합 될 때 전반적으로, 우리의 결과는 X 선 결정학 및 생물 물리학 적 방법의 힘을 보여줍니다. 이러한 접근법을 사용하면, T 세포 항원 인식을 적용 정확한 분자 메커니즘을 절개 할 수있다. 실제로, 구조적 변화가 항원 차별 49, 50, 51 중 역할을 할 수있는 방법을 보여주는 unligated TCR도의 구조를 해결하기 위해이 방법을 사용하는 것도 가능하다. TCR-pHLA 상호 작용을 뒷받침 매우 복잡하고 동적 인 특성의 이해는 치료 설계를위한 명백한 의미를 가지고있다. 직접 변형 항원 recognitio에 치료 표적이되고있는 분자뿐만 아니라 효과를 "볼"수 있다는N, 분명히 앞으로 이러한 의약품의 개발이 향상됩니다. 이 연구에서 우리는 심하게 TCR에 의해 결합되지 않은 단일 펩티드 잔류 심지어 변화가 예측할 수 차례, 극적으로 T 세포의 인식을 변화의 HLA-결합 된 펩타이드, 다른 잔류 물에 구조적 변화를 전송할 수 있음을 보여준다. 인간 질병의 광범위한 미래 요법을 설계 할 때 T 세포의 항원 인식시 사용되는 분자 기전의보다 완전한 이해는 상당히 유익 할 것이다.
The authors have nothing to disclose.
BM은 영국 암 연구 박사 과정 재학 지원됩니다. AG는 생명 과학 연구 네트워크 웨일즈 박사 과정 재학 지원됩니다. VB는 암 연구 웨일즈 박사 과정 재학 지원됩니다. DKC는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 연구 경력 개발 연구원 (WT095767)입니다. AKS는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)의 탐정이다. GHM은 공동으로 생명 과학 연구 네트워크 웨일즈 Tenovus 암 치료 박사 과정 재학 재정 지원된다. 우리는 시설과 지원을 제공하기 위해 다이아몬드 광원에서 직원을 감사드립니다.
S.O.C. media | Invitrogen |
Orbi-Safe New Orbit incubator | Sanyo |
carbenicillin | Sigma |
IPTG | Fisher |
Quick Coomassie Stain SafeStain | Generon |
Legend RT centrifuge | Sorvall |
Tris | Fisher |
magnesium chloride | Arcos |
NaCl | Fisher |
glycerol | Sigma-Aldrich |
Sonopuls HD 2070 | Bandelin |
DNAse | Fisher |
Triton | Sigma-Aldrich |
EDTA | Fisher |
guanidine | Fisher |
NanoDrop ND1000 | Thermo |
Peptides | Peptide Protein Research |
dithiothreitol | Sigma-Aldrich |
L-arginine | SAFC |
cysteamine | Fisher |
cystamine | Fisher |
dialysis tubing | Sigma-Aldrich |
urea | Sigma-Aldrich |
Metricel 0.45 μm membrane filter | Pall |
POROS 10/100 HQ | Applied biosystems |
ÄKTA pure FPLC system | GE Healthcare Life Sciences |
10 kDa MWCO Vivaspin 20 | Sartorius |
10 kDa MWCO Vivaspin 4 | Sartorius |
Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences |
Phosphate Buffer Saline | Oxoid |
BIAcore buffer HBS | GE Healthcare Life Sciences |
Biotinylation kit | Avidity |
BIAcore T200 | GE Healthcare Life Sciences |
CM5 chip coupling kit | GE Healthcare Life Sciences |
streptavidin | Sigma-Aldrich |
Microcal VP-ITC | GE Healthcare Life Sciences |
Hepes | Sigma-Aldrich |
Gryphon crystallisation robot | Art Robbins Instruments |
Intelli-plate | Art Robbins Instruments |
Crystallisation screens and reagents | Molecular Dimensions |
75 cm2 flask | Greiner Bio-One |
0.22 μm filters | Miller-GP, Millipore |
Ultra-Clear ultracentrifuge tube | Beckman Coulter |
Optima L-100 XP with SW28 rotor | Beckman Coulter |
CD8 microbeads | Miltenyi Biotec |
anti-CD3/CD28 Dynabeads | Invitrogen |
anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec |
CK medium, PHA | Alere Ltd |
anti-TCRVβ mAb | BD |
dasatinib | Axon |
MIP-1β and TNFα ELISA | R&D Systems |
51Cr | PerkinElmer |
1450 Microbeta counter | PerkinElmer |