In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy per la multi-resistente baumannii Acinetobacter Masterizzare Infezioni Utilizzando bioluminescenza Imaging
Summary
Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.
Abstract
Bruciano le infezioni continuano ad essere una causa importante di morbilità e mortalità. La crescente emergere di (MDR) batteri multiresistenti ha portato alla frequente fallimento dei trattamenti tradizionali antibiotici. terapie alternative sono urgentemente necessari per affrontare i batteri MDR.
Un approccio non antibiotico innovativo, antimicrobico luce blu (ABL), ha dimostrato efficacia contro le infezioni promettente MDR. Il meccanismo di azione di ABL non è ancora ben compreso. È comunemente ipotizzato che naturalmente cromofori fotosensibilizzanti endogeni nei batteri (ad esempio, porfirine esenti da ferro, flavine, etc.) sono eccitati da abl, che a sua volta produce specie reattive dell'ossigeno citotossici (ROS) attraverso un processo fotochimico.
A differenza di un altro approccio antimicrobico a base di luce, antimicrobico terapia fotodinamica (aPDT), la terapia ABL non richiede il coinvolgimento di un photosensitiz esogenaER. Tutto ciò che serve per entrare in vigore è l'irradiazione di luce blu; pertanto, è semplice e poco costoso. I recettori ABL sono i fotosensibilizzatori endogeni cellulari nei batteri, piuttosto che il DNA. Così, ABL è ritenuto essere molto meno genotossico alle cellule ospiti di irradiazione ultravioletta-C (UVC), che provoca direttamente danni al DNA in cellule ospiti.
In questo articolo, vi presentiamo un protocollo per valutare l'efficacia della terapia ABL per MDR Acinetobacter baumannii infezioni in un modello murino di ustioni. Utilizzando un ceppo bioluminescente ingegnerizzato, siamo stati in grado di monitorare in maniera non invasiva il grado di infezione in tempo reale in animali viventi. Questa tecnica è anche un efficace strumento di controllo della distribuzione spaziale delle infezioni negli animali.
Introduction
Bruciare infezioni, che sono riportati di frequente causa di infortuni termici cutanee, continuano ad essere una causa importante di morbilità e mortalità 1. La gestione delle infezioni ustione è stata ulteriormente compromessa dalla crescente emergere di (MDR) ceppi batterici multiresistenti 2 a causa dell'uso massiccio di antibiotici. Un importante batteri MDR Gram-negativi è Acinetobacter baumannii, che è noto per essere associato con le recenti ferite in battaglia ed è resistente a quasi tutti gli antibiotici disponibili 3. La presenza di biofilm in foci ferito 'stato segnalato 4, 5 e si crede ad aggravare la tolleranza agli antibiotici e difesa dell'ospite 6, 7, causando infezioni persistenti 8, 9. Pertanto, v'è una pressing bisogno per lo sviluppo di trattamenti alternativi. Nella strategia nazionale recentemente annunciato per la lotta contro batteri resistenti agli antibiotici, lo sviluppo di terapie alternative agli antibiotici è stato notato come un'azione da parte del governo degli Stati Uniti 10.
approcci antimicrobici basati leggeri, come indica il nome, impongono l'irradiazione di luce con o senza altri agenti. Questi approcci includono la terapia antimicrobica fotodinamica (aPDT), ultravioletto-C (UVC) irradiazione, e la luce blu antimicrobica (ABL). In studi precedenti, hanno dimostrato l'efficacia promettenti nell'uccidere MDR ceppi batterici 11, 12, 13. Tra i tre approcci basati sulla luce, ABL ha attirato sempre più attenzione negli ultimi anni grazie alle sue proprietà antibatteriche intrinseche senza l'uso di fotosensibilizzanti 14. in Comparison a aPDT, ABL coinvolge solo l'uso di luce, mentre aPDT richiede una combinazione di luce e un fotosensibilizzatore. Pertanto, ABL è semplice e poco costoso 14. In confronto a UVC, ABL si crede che sia molto meno citotossici e genotossici alle cellule ospiti 15.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di indagare l'efficacia della ABL per il trattamento delle infezioni causate da ustione MDR A. baumannii in un modello murino. Usiamo batteri patogeni bioluminescenti per sviluppare nuovi modelli murini di infezioni ustionati che permettono il monitoraggio non invasivo della carica batterica in tempo reale. Rispetto al metodo tradizionale di campionamento del fluido / tessuto e successiva placcatura e conteggio delle colonie 16, questa tecnica fornisce risultati accurati. Il processo di campionamento del tessuto potrebbe introdurre un'altra fonte di errore sperimentale. Poiché l'intensità di luminescenza batterica è linearmente proporzionale alla corresristagni batterica CFU 17, possiamo misurare direttamente la sopravvivenza dei batteri dopo una certa dose di irradiazione di luce. Monitorando la carica batterica negli animali che vivono ricevere il trattamento di luce in tempo reale, la cinetica di uccisione di batteri possono essere caratterizzati utilizzando un numero notevolmente ridotto di topi.
Protocol
Representative Results
Discussion
ABL è un nuovo metodo per il trattamento delle infezioni. Dal momento che il suo meccanismo d'azione è completamente diversa da quella della chemioterapia, è più di una fisioterapia. L'agente che media l'effetto antimicrobico è blu irradiazione di luce (400-470 nm). Con lo sviluppo di LED blu, abbiamo guadagnato l'accesso a un approccio antimicrobica a base di luce efficace e semplice per le infezioni MDR.
In questo protocollo, abbiamo descritto lo sviluppo di un modello…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Center for Integration of Medicine and Innovative Technology (CIMIT) under the U.S. Army Medical Research Acquisition Activity Cooperative Agreement (CIMIT No. 14-1894 to TD) and the National Institutes of Health (1R21AI109172 to TD). YW was supported by an ASLMS Student Research Grant (BS.S02.15). We are grateful to Tayyaba Hasan, PhD at the Wellman Center for her co-mentorship for YW.
Materials
| IVIS | PerkinElmer Inc, Waltham, MA | IVIS Lumina Series III | Pre-clinical in vivo imaging |
| Light-emitting diode LED | VieLight Inc, Toronto, Canada | 415 nm | Light source for illumination |
| Power/energy meter | Thorlabs, Inc., Newton, NJ | PM100D | Light irradiance detector |
| Mouse | Charles River Laboratories, Wilmington, MA | BALB/c | 7-8 weeks age, 17-19 g weight |
| Acinetobacter baumannii | Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX | Clinical isolate | Engineered luminescent strain |
| Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 721016 | 0.9% Sodium Chloride |
| Phosphate Buffered Saline, 1X Solution | Fisher Scientific | BP24384 | A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures |
| Brain Heart Infusion | Fisher Scientific | B11059 | Bacterial culture medium |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | For bacterial suspension centrifuge |
| Benchtop Incubated Orbital Shakers | Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH | Incu-Shaker Mini | For culturing of bacteria |
| Inoculating Loops | Fisher Scientific | 22-363-605 | For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice |
| Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200µL | Fisher Scientific | 02-707-502 | Pipet Tips |
| Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-220 | For bacterial suspension seperation |
| Brass Block | Small Parts, Inc., Miami, FL | 10 mm by 10 mm | For creation of burns in mice |
| Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves | Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY | PBI83514 | Heat Resistant Gloves |
| Greiner dishes | Sigma-Aldrich Co. LLC | P5112-740EA | 35 mm ×10 mm |
| Corning Digital Hot Plate | Cole-Parmer Instrument Company, LLC | UX-84301-65 | 10" x 10", 220 VAC, for boiling water |
| Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed | E-Z Systems | EZ-211 | Prevents heat loss and hypothermia during surgery |
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