Nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per l'identificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine

Sommario

Descriviamo qui un metodo per identificare fosforilazioni multiple di una proteina intrinsecamente disordinata mediante Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR), utilizzando la proteina Tau come caso di studio. La Tau ricombinante viene arricchita isotopicamente e modificata in vitro da una chinasi prima dell'acquisizione e dell'analisi dei dati.

Abstract

Gli aggregati della proteina Tau neuronale si trovano all'interno dei neuroni dei pazienti con malattia di Alzheimer. Lo sviluppo della malattia è accompagnato da un'aumentata fosforilazione anomala della Tau. Nel corso dell'indagine molecolare delle funzioni e delle disfunzioni della Tau nella malattia, la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) viene utilizzata per identificare le fosforilazioni multiple della Tau. Presentiamo qui protocolli dettagliati di produzione ricombinante di Tau nei batteri, con arricchimento isotopico per studi NMR. Vengono descritte le fasi di purificazione che sfruttano la stabilità al calore e l'alto punto isoelettrico della Tau. Il protocollo per la fosforilazione in vitro di Tau da parte di ERK2 attivata ricombinante consente di generare fosforilazioni multiple. Il campione proteico è pronto per l'acquisizione dei dati al momento di questi passaggi. Successivamente viene considerata l'impostazione dei parametri per avviare la registrazione sullo spettrometro. Infine, viene spiegata la strategia per identificare i siti di fosforilazione della Tau modificata, sulla base dei dati NMR. Viene discusso il vantaggio di questa metodologia rispetto ad altre tecniche utilizzate per identificare i siti di fosforilazione, come l'immunorilevazione o la spettrometria di massa (MS).

Introduzione

Una delle principali sfide della sanità nel 21 ^° secolo, sono le malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (AD). Tau è una proteina associata ai microtubuli che stimola microtubuli (MT) formazione. Tau è ugualmente coinvolto in diverse malattie neurodegenerative, le cosiddette tauopatie, di cui il più noto è AD. In questi disturbi, Tau auto-aggregati in filamenti elicoidali appaiati (PHFS) e si trova modifica per molti residui di modificazioni post-(PTM), come la fosforilazione ^1. La fosforilazione della proteina tau è implicata nella regolazione sia della sua funzione fisiologica di stabilizzazione MT e la perdita patologica di funz....

Protocollo

1. Produzione di ¹⁵ N, ¹³ C-Tau (figura 1)

1. Trasforma pET15b-Tau ricombinante T7 plasmide di espressione ^13,14 in BL21 (DE3) competente Escherichia coli cellule batteriche ^15.
   NOTA: la codifica cDNA per la più lunga (441 residui di aminoacidi) Tau isoforma viene clonato tra NcoI e XhoI siti di restrizione del plasmide pET15b.
   1. Mescolare delicatamente 50 ml di BL21 competente cellule (DE3), formando 1-5 x 10 ⁷ colonie per mg di DNA plasmidico, con 100 ng di DNA plasmidico in un tubo di plastica da 1,5 ml.
      NOTA: Codone-utilizzo ottimizzato ceppi batterici p....

Risultati

La figura 3A mostra un grande picco di assorbimento a 280 nm osservati durante il gradiente di eluizione. Questo picco corrisponde alla proteina Tau purificata come visto sul gel di acrilammide sopra il cromatogramma. Figura 3B mostra un picco di assorbimento ben separati a 280 nm e picco di conducibilità, assicurando che dissalazione della proteina è efficiente. La figura 4 mostra proteina gel-shift osservato mediante analisi SDS-PAGE ¹⁶ caratteristico multiple fosforilazione pr.......

Discussione

Abbiamo usato la spettroscopia NMR per caratterizzare campioni Tau enzimaticamente modificati. L'espressione ricombinante e purificazione qui descritta per la proteina Tau umano full-length possono allo stesso modo essere utilizzati per produrre mutanti Tau o Tau domini. Isotopicamente proteina arricchito è necessaria per la spettroscopia NMR, rendendo necessario l'espressione ricombinante. Identificazione dei siti di fosforilazione richiede l'assegnazione di risonanza e un ¹⁵ N, ¹³ C p.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
pET15B plasmide di espressione T7 ricombinante	Novagen	69257	Mantenere a -20 ° C
BL21 (DE3) trasformazione competente E. coli batteri	New England Biolabs	C2527I	Tenere a -80 ° C
Brodo LB autoclavato, Lennox	DIFCO	240210
Complementi vitaminici MEM	Sigma	58970C	Integratore di terreno per la crescita batterica
15N, 13C-ISOGRO polvere media completa	Sigma	608297	Integratore di terreno per la crescita batterica
15NH4Cl	Sigma	299251	Isotopo
13C6-glucosio	Sigma	389374
inibitori della proteasi isotopica	Roche	5056489001	Mantenere a 4 gradi C
1 compressa in 1 ml è una soluzione 40x che può essere conservata a -20 gradi C
DNaseI	EUROMEDEX	1307	Mantenere a -20 ° C
Omogeneizzatore (EmulsiFlex-C3)	AVESTIN		Lysis è realizzato a 4 ° C
Pierce™ Proteina non colorata MW Marker	Pierce	266109
chinasi MEK1 umana attiva, GST Tagged	Sigma	M8822	Mantenere a -80 ° C
AKTÄ Sistema cromatografico puro	GE Healthcare		FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (colonna da 5 ml)	GE Healthcare	17-5156-01	Colonne cromatografiche a scambio cationico
HiPrep 26/10 Desalinizzazione	GE Healthcare	17-5087-01	Colonna di desalinizzazione delle proteine
PD MidiTrap G-25	GE Healthcare	28-9180-08	Colonna di desalinizzazione delle proteine
Tris D11, 97% D	Cortecnet	CD4035P5	Tampone NMR deuterato
5 mm Microprovetta simmetrica SHIGEMI D2O (set di 5 tubi interni ed esterni)	Euriso-top	BMS-005B	NMR Shigemi
Tubes eVol kit-starter kit siringa elettronica	Cortecnet	2910000	Pipettaggio
Bruker 900 MHz AvanceIII con testa di sonda criogenica a tripla risonanza	Spettrometro Bruker NMR per acquisizione dati	Bruker
600 MHz Avance con testa di sonda criogenica a tripla risonanza	Spettrometro Bruker		NMR per acquisizione dati
TopSpin 3.1	Bruker		Software di acquisizione ed elaborazione per esperimenti NMR
Sparky 3.114	UCSF (T. D. Goddard e D. G. Kneller)		Software di analisi dei dati NMR

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