En effektiv metode for Isolering av høyt renset RNA fra frø for bruk i Quantitative Analysis transcriptome
Summary
We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.
Abstract
Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.
Introduction
Planter produserer frø, som gir opphav til den neste generasjon. Frø akkumulere store mengder lagringsplass reserver, slik som oljer, karbohydrater og proteiner, for post-germinative vekst. Mennesker utnytte frø lagerbeholdningen som kilder til mat og fôr, og dermed plante frø er en av de største leverandørene av spiselig organisk materiale over hele verden. Økende frø avlinger er en viktig utfordring i plantevitenskap.
Siden frø lagerbeholdningen er kommersielt verdifulle kilder til mat og industrielle materialer, har de molekylære mekanismer som ligger til grunn for regulering av metabolismen av disse reservene blitt vidt undersøkt 1-6. Videre belyse disse mekanismene vil være nyttig for å øke frø avlinger i avlinger. Frø utvikle seg i plante eggstokkene etter befruktning, og de modnes gjennom en rekke utviklingsstadier 1,6,7. Videre forstå den molekylære mekanismen underliggende frø utvikling krever detaljert, Presise genekspresjonsprofiler fra en serie av utviklende frø som skal fremstilles. Imidlertid er store mengder av oljer, proteiner, karbohydrater og polyfenoler i plantefrø gjør det vanskelig å isolere høyt renset RNA, som utelukker nøyaktig profilering av genekspresjon.
Her introduseres en effektiv metode for RNA-isolering fra oljefrø som inneholder store mengder av oljer, proteiner og polyfenoler. Ved hjelp av denne metoden, vil forskerne kunne forberede høyt renset RNA. Slike RNA vil være nyttig for å overvåke transkripsjons endringer i viktige gener som kontrollerer metabolsk regulering av frø lagerbeholdningen i å utvikle og modne oljefrø.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genuttrykk profiler bidra til vår forståelse av plantefysiologi; derfor har bestemt RNA isolasjon metoder er utviklet for hver prøve tilstand 9-12. Vi undersøkte de prosessene som ble hemmet under RNA isolert fra frø og fant at RNA binding til silika membraner var sterkt hemmet. Store mengder olje, proteiner og polyfenoler hemme RNA isolering. Vi modifisert RNA ekstraksjon prosessen for å fjerne disse forbindelser med en lyseringsoppløsning før prosessen med binding til RNA silika membraner. De viktig…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker de ansatte for funksjonell genom Facility og spektrografi og Bioimaging Facility, NIBB kjerneforskningsfasiliteter, og Model Plant Research Facility, NIBB Bioresource Center.
Materials
| RNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P5288-100G | |
| HOMOGENIZER S-303 | AS ONE | 1-1133-02 | |
| NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-NDL-US-CAN | |
| PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA | RR037A | |
| KAPA SYBR Fast qPCR kit | Kapa biosystems | KK4601 |
Riferimenti
- Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
- Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).
- Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
- Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
- Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
- Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
- Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
- Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
- Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
- Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
- Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
- Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).
