Метод для измерения Метаболизм в отсортированном субпопуляции сложных сообществ клеток с использованием стабильных изотопов Tracing
Summary
This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.
Abstract
Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of “mock sorted” cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.
Introduction
Высшие организмы содержат сложные сообщества различных типов клеток, которые взаимодействуют, чтобы вызвать более сложных функций. Например, опухоли содержат не только раковые клетки, но также и фибробласты, клетки , которые составляют кровеносные сосуды, и часто иммунной клетки инфильтратах 1; Кровь содержит сложную смесь десятков подвидов клеток иммунной системы 2; и даже культивируемые клеточные линии могут состоять из нескольких субпопуляций, таких как полостную и базальных подтипов клеток рака молочной железы 3. Более того, различные типы клеток, которые сосуществуют могут проявлять метаболическую "сотрудничество". Например, в головном мозге, астроциты , как полагают , для превращения глюкозы в лактат, который затем "кормили" на нейроны , которые окисляют этот субстрат 4; Т – лимфоциты , в некоторых контекстах , зависящих от соседних дендритных клеток в качестве источника цистеина 5; и раковые клетки могут взаимодействовать с AssoФибробласты в лем, связанных опухолей 6. Чтобы понять метаболическую поведение таких систем, необходимо отделить и измерить метаболической активности различных типов клеток, присутствующих.
До сих пор наиболее широко используемый метод для разделения типов клеток является флуоресценция активированных сортировки клеток. Этот метод широко применим, при условии, что тип клеток или состояние интереса может быть "меченый" с использованием флуоресцентных антител, экспрессию сконструированных флуоресцентные белки или другие красители. Одним из вариантов является изначально отдельных типов клеток через ячейку сортировщика, повторно культуры отдельные типы клеток , полученные, а затем проводить исследования метаболизма этих культур 7. Тем не менее, это только осуществимо, если тип клеток или фенотип стабилен в условиях культивирования, и не могут захватывать переходное поведение, такие как состояния клеточного цикла, ни метаболического сотрудничества в совместных культурах. Для таких случаев, обмен веществ должно быть измерено непосредственно на такrted клетки. Это является сложной задачей , так как клетка процедуры сортировки подвергает клетки к стрессам , которые могут исказить их метаболизм 8, и мы отдаем себе отчет лишь несколько исследований такой подход 9, 10. В частности, мы обнаружили , что основные метаболиты , такие как аминокислоты могут вытечь из клеток , хранящихся в буфере сортировки клеток, таким образом , что измерения абсолютной метаболита изобилии перестают быть надежными 11 (хотя относительное сравнение между отсортированных фракций все еще может быть ценным).
Чтобы обойти эти проблемы, мы обозначаем клетки со стабильными изотопами до сортировки, и сосредоточить внимание на MIDs в клеточных метаболитов, а не метаболит содержаний. Так как MIDs формируются в течение более длительных временных масштабах, они должны быть менее подвержены воздействию кратковременного воздействия условий сортировки. Мы количественно с помощью масс-мобильные интернет-устройства спектрометрии высокого разрешения полного сканирования, которое является достаточно чувствительным, чтобы обеспечить йата на сотни метаболитов, начиная с приблизительно 500 000 отсортированных клеток, требующих около 30-60 мин времени сортировки клеток. Сравнение между "издеваться" сортируется управления (клетки, передаваемые через клеточный сортер инструмента без стробирования какой-либо конкретной популяции) и экстракции метаболита непосредственно из культуры блюдо сделано, чтобы гарантировать, что наблюдаемые MIDs являются репрезентативными в исходной культуре. В зависимости от выбора стабильных изотопных индикаторов, различные метаболические пути могут быть изучены с помощью этого метода.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наш метод основан на принципе, что MIDs в клеточных метаболитов отражает "историю" метаболической активности клетки. Это дает возможность исследовать метаболические деятельности в субпопуляции клеток, так как они имели место в сложном сообществе клеток, до процедуры сортировки кл?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Anas Kamleh for valuable help with optimizing mass spectrometry methods, and Annika von Vollenhoven for assistance with cell sorting. This research was supported by the Swedish Foundation for Strategic Research (grant no. FFL12-0220) and the Strategic Programme in Cancer Research (IR, RN); the Swedish Heart-Lung Foundation (CEW, HG); and Mary Kay Foundation (JW, MJ).
Materials
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree – MC – VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20×2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| MYRSYRA 99.5% OPTIMA (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5ml, 8-425 32×11.6mm,amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 LOCK SKRUV VITT PTFE PACKNING 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
Riferimenti
- Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
- Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
- Prat, A., et al. Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes. Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).
- Magistretti, P. J., Allaman, I. A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging. Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).
- Angelini, G., et al. Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).
- Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma. Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).
- Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis. Virology. 415 (2), 153-159 (2011).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Moussaieff, A., et al. High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).
- Johnson, C., et al. A metabolic signature of colon cancer initiating cells. Cancer Metab. 2, 32 (2014).
- Roci, I., et al. Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells. Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).
- Shapiro, H. . Practical flow cytometry. , (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Noack, S., Wiechert, W. Quantitative metabolomics: A phantom. Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).
