Magnetisk levitation Tillsammans med Portable Imaging och analys for Disease Diagnostics

Summary

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

Abstract

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient’s cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

Introduction

Här presenterar vi en teknologiplattform och en teknik som använder magnetisk levitation i kombination med automatiserad bildbehandling och analys för att analysera fördelningen av en patients celler densitet som en indikator för sjukdom. Denna mångsidiga tillvägagångssätt för densitetsbaserad cytometrisk analys kan i slutändan tillämpas på en rad diagnostik sjukdomar. Men för att vara kompatibel med point-of-care testning och användning i utvecklingsländerna, måste tekniken uppfyller kraven på låg kostnad, bärbarhet och användbarhet. Anordningen och förbrukningsvaror måste vara lätt erhållas till en låg kostnad. Vid provberedningen måste vara enkel, bör analysen automatiseras med minimala krav på användarinmatning eller tolkning och resultat ska returneras snabbt. Vidare måste apparaten vara kompakt och portabel att vara användbar i kliniska miljöer samt utvecklingsländerna. Därför har vi utvecklat en anordning och metod för att använda magnetisk levitation i point-of-care-kompatibel Technolnik genom koppling automatiserad bildbehandling och bildanalys för att visa resultatet om fördelningen av en population av en patients celler densitet.

Point-of-care teknik ger en märkbar fördel gentemot aktuella kliniska laboratorietestprocedurer. Den teknik som finns tillgänglig är för dyrt att ägas av en läkare eller för komplexa för att utföras av sjukvårdspersonal. Många av dessa förfaranden kräver arbetsintensiva protokoll som skall utföras av en utbildad tekniker. Av dessa skäl är patientprover såsom blod eller urin i allmänhet samlas i läkarens kontor överfördes sedan till en avlägsen, centraliserad testlaboratorium för klinisk testning, vilket kan ta flera dagar för läkaren att få resultatet av testet. Detta kan leda till förseningar eller komplikationer i samband med behandling i vissa fall gör denna testning mycket kostsam och ineffektiv (orsakar en ekonomisk börda för försäkrings betalare), och vidare gör mångadiagnostik otillgängliga i resurssnåla inställningar och utvecklingsländer.

Här presenterar vi en magnetisk levitation teknik i kombination med automatiserad bildbehandling och analys i både en enhet med inbyggd bildbehandling och bearbetning (figur 1) och en smartphone-kompatibel enhet (Figur 2). Dessa magnetisk levitation-baserade enheter representerar en brett tillämpbar plattformsteknologi som har potential som skall tillämpas på en rad olika medicinska diagnostiska tillämpningar. De magnetiska levitation inflygnings funktioner baserade på en jämvikt mellan två krafter: en magnetisk kraft och en flytkraft ^{1, 2, 3.} När en partikel är upphängd i en paramagnetisk medium och insatt i ett magnetfält som genereras av två magneter med lika poler vända mot varandra, en magnetisk kraft verkar på partikeln i riktningen mot centrumlinjen mellan de två magn ets. Flytkraften som orsakas av den relativa densiteten hos partikeln jämfört med suspensionsmediet och är uppåt i fallet med partiklar mindre täta än det mediet och nedåt i fallet med partiklar med högre densitet än det omgivande mediet. Baserat på dessa två krafter, kommer partiklarna når en jämvikt levitation position inom området som balanserar dessa två krafter; denna position är direkt relaterad till densiteten hos partikeln, med tätare partiklar svävar lägre inom området än mindre täta partiklar. En bildgenererande modulen, antingen en inbyggd smartphone kamera ^{4, 5, 6} eller oberoende optiska komponenter som är utrustade med en förstoringslins ^{7, 8,} används för att visualisera positionerna för partiklarna. Bildbehandling, antingen genom en smartphone ansökan ^{4, 5,}= "xref"> 6 eller en inbäddad behandlingsenhet ^{7, 8,} behandlar sedan de tagna bilderna för att kvantifiera den geografiska fördelningen och därmed fördelningen av befolkningstäthet. För att analysera större prov (såsom de med endast ett fåtal partiklar av intresse per milliliter, kan flöde integreras direkt i enheten sådana partiklarna svävande och analyseras när de passerar genom avbildningsregionen (Figur 2).

Figur 1: Sluten magnetisk levitation Platform. (A) Kompakt magnetisk levitation anordning innefattande en magnetisk fokusering modul, avbildande komponenter (en lysdiod (LED), en optisk lins, och en kamera detektor), och en behandlingsenhet med en bildskärm. (B) Magnetisk fältstyrka i cross-sektionen av området mellan magneterna där provet insatta. Fältstyrkan är som störst vid ytan av magneterna och närmar sig noll vid centrumlinjen mellan dem. (C) partiklar, såsom celler, inom de magnetfält experience flera krafter: en magnetisk kraft (F _m) mot centrumlinjen mellan de magnetics, med magnitud varierar baserat på positionen för partikeln; en gravitationskraft (F _g '), som är beroende av partikeldensiteten i förhållande till den hos suspensionsmediet, och en dragkraft (F _d) motstånd mot partikelrörelse. Reproduceras, med tillåtelse, från Yenilmez, et al. ⁸ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Fikonure 2: Smartphone-kompatibel Flow-assisterad magnetisk levitation Platform. (A – c) Fram (a), sida (b), och tillbaka (c) vyer av magnetisk levitation enhet (d) Komponenterna i enheten inkluderar: 1) Magnetisk levitation modul, inklusive permanentmagneter, förstoringsglas, och en LED och ljus diffusor, 2) smartphone fall, 3) elektronik, inklusive en mikrokontroller, pump förare, och Bluetooth-mottagare, 4) mikropumphållare, 5) justerbar öppning, 6) avfall rörhållaren, 7) batterihållaren, 8 ) provhållare, 9) dubbel funktion monter och lock. (E) Flödesschematisk, som visar pumpning av provet genom det magnetiska fältet. (F) Tvärsnitt av magnetisk levitation modulen, som visar hur partiklar av olika densiteter kommer att anpassa de pumpas genom fältet; mindre täta partiklar, såsom Particle 1, kommer i jämvikt vid en högre levitation höjden tHan tätare partiklar, såsom partikel 2. reproduceras, med tillåtelse, från Amin et al. ¹ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Minimikraven för användning av prov för analys täthetsfördelningen i detta system inkluderar möjligheten att erhålla en suspension av celler eller partiklar större än ca 5 fim och mindre än cirka 250 um i storlek (för avbildning och bildbehandling) och dess förenlighet med blandning i en lösning av en paramagnetisk lösning såsom den gadobutrol användas här. För diagnostik av sjukdom, kompatibla program inkluderar de i vilka (i) celler av intresse i sig ha en förändrad täthet när de bär en sjukdom jämfört med friska kontroller, (ii) en densitet förändring kan induceras i cellen genom tillsats av ett reagens eller en del alternativ behandling för en kort icubation tid, eller (iii) olika celltyper håller på att identifieras i ett enda prov och i sig (eller via någon behandling) har unika karakteristiska densiteter.

Sicklecellsjukdom är en genetisk sjukdom som orsakar en muterad form av hemoglobin, HbS, att produceras i en persons röda blodkroppar (RBC), vilket kan resultera i intermittenta vaso-ocklusiva händelser och kronisk hemolytisk anemi ^9. Det diagnostiseras med antingen hemoglobin isoelektrisk fokusering, HPLC (HPLC) fraktionering, eller hemoglobin elektrofores som är mycket exakt, men måste utföras i ett kliniskt testlaboratorium, eftersom de är oförenliga med point-of-care inställningar. Löslighet och pappersbaserade tester för sicklecellanemi har föreslagits, men kräver i allmänhet subjektivt användar tolkning och bekräftande tester. Här använder vi en densitetsbaserad metod för att identifiera skäran RBC, som uppnår en högre densitet än RBCs från personer utan sicklecellsjukdom. Mekanismen inbegriper polymerisation av den muterade formen av hemoglobin, HbS, som orsakar RBC uttorkning hos sickle RBCs cellsjukdomen under deoxygenerade betingelser ^{10, 11, 12, 13.}

Kan också tillämpas denna densitet baserad metod för att separera celler av olika typer på grundval av densitet: vita blodkroppar (WBC) och röda blodkroppar ^7. VBK är i allmänhet ansvariga för att bekämpa infektioner i kroppen. WBC cytometry kan användas för att kvantifiera antal av dessa celler i blodet och fungerar som ett användbart diagnostiskt verktyg. WBC räknar högre än normalt (i allmänhet vara större än 11.000 celler per mikroliter) kan tyda på infektion, immun nervsystemet, eller leukemi. WBC räknar under det normala intervallet (cirka 3500 celler per mikroliter) kan orsakas av autoimmuna sjukdomar eller conditjoner som skador benmärg. Till skillnad från alternativa tekniker, gör processen presenteras här förlitar sig på lys av RBC eller fläckar i syfte att identifiera VBK. Denna cell-baserat test drar fördel av de unika inneboende densiteterna hos de två celltyper för att utföra separation, eftersom WBC-populationen densiteten har rapporterats vara lägre än den hos RBC befolkningen som tidigare beräknats med användning av densitetsgradientcentrifugering ^{2, 3.}

Jämfört med alterative testning på avlägsna platser, är detta test en snabb, med enkla provberedning (Figur 3), separation av celler i anordningen ligger inom 10 – 15 min, och automatiserad bildbehandling och analys som kräver mindre än 1 min. På detta sätt kan enheten ger resultat snabbt att bättre informera medicinska beslut, tillåta behandling ges omedelbart för att lindra fysisk och psykisk smärta, och minska risken för komplikationer Associpade med en fördröjning i sjukvården. Denna teknik kan utföras på plats, antingen i kliniska situationer på grund av enkla provberedning och automatiserad bildbehandling och analys, som ger ett resultat med minimal användarinmatning eller tolkning. På grund av användningen av en enkel metod att använda permanentmagneter för provanalys och användning av antingen en smartphone eller enkla elektriska komponenter för avbildning och bildbehandling, enheten samt per-testet kostnaderna är minimala jämfört med vissa sofistikerade testförfaranden.

Protocol

Etisk Uttalande: Alla procedurer involverande humana blodprov utfördes i enlighet med de institutionella föreskrifter. Alla protokoll granskades och godkändes av Institutional Review Board. Ett informerat samtycke gavs av alla deltagare. 1. Provberedning för sicklecellsjukdom Diagnos 5, 8 Bered en 50 mM lösning av gadobutrol i Hanks balanserade saltlösning (HBSS). Lös upp 10 mM natriummetabisulfit i gadoli…

Representative Results

För celldensitet fördelningsanalys, vilket är den teknik som används för sicklecellsjukdom diagnos, är syftet att identifiera bredden av fördelningen av cellpopulationen. Blodkroppar från patienter utan sicklecellanemi kommer att begränsas inom en förutsägbar bredd. Celler från patienter med sicklecellanemi kommer att distribueras under en större region, med en nedåtgående skevhet i cellfördelningen (se figur 4.) För varje särskild tillämpning, kan en …

Discussion

Kritiska steg i protokollet
Kritiska faktorer i denna process inkluderar den korrekt inriktning av magneterna. Om magneterna lossna eller separerade mer än normalt i anordningen, kan detta påverka resultaten. För att kontrollera för detta fel eller andra i processen, en densitet kontrollerad partikel, såsom polystyren-mikrosfärer, kan användas periodiskt för att kontrollera för förändringar över tiden. Vidare är levitation tid viktigt att tillåta cellerna att nå jämvikt. För röda blodkroppar, ä…

Materials

Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 mL vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na2S2O5
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201