Chippen-exo Metode: Identifikation Protein-DNA interaktioner med nærheden Base Pair Precision
Summary
Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.
Abstract
Kromatin immunofældning (chip) er et uundværligt redskab inden for epigenetik og genregulering, der isolerer specifikke protein-DNA interaktioner. Chip koblet til high throughput sekventering (chip-seq) er almindeligt anvendt til at bestemme den genomiske placering af proteiner, der interagerer med kromatin. Imidlertid er chip-seq hæmmet af forholdsvis lav kortlægning opløsning på flere hundrede basepar og høj baggrundssignal. Chippen-exo-metoden er en raffineret udgave af chip-seq, der væsentligt forbedrer både opløsning og støj. Det centrale skelnen af chip-exo metode er inkorporeringen af lambda exonucleasefordøjelse i biblioteket forberedelse workflow til effektivt fodaftryk venstre og højre 5'DNA-grænser af proteinet-DNA krydsbinding site. Chippen-exo biblioteker underkastes derefter high throughput sekventering. De resulterende data kan udnyttes til at give unikke og ultra-høj indsigt opløsning til den funktionelle organisation of genomet. Her beskriver vi chippen-exo-metoden, som vi har optimeret og strømlinet for mammale systemer og næste generation sekventering-by-syntese platform.
Introduction
Chromatin immunoprecipitation (chip) er en kraftfuld metode til at studere mekanismer genregulering ved selektivt at berige for DNA-fragmenter, der interagerer med et givet protein i levende celler. Fremgangsmåder til chip-beriget DNA-fragmenter Detection har udviklet sig som teknologien forbedres, fra detektering af et enkelt locus (standard chip-qPCR) til hybridisering på oligonucleotid-mikroarrays (chip-chip) til high-throughput sekventering (chip-seq) 1. Selvom chip-seq har set udbredt anvendelse, kromatin heterogenitet og uspecifikke DNA interaktioner er hæmmet datakvalitet, der fører til falsk positive og upræcis kortlægning. For at omgå disse begrænsninger, Dr. Frank Pugh udviklet chip-exo metode 2. Den iøjnefaldende træk ved chip-exo er, at de indeholder et 5 'til 3' exonuklease, effektivt footprinting transkriptionsfaktor bindende steder. Som følge heraf chippen-exo metode opnår højere opløsning, større dynamikområde detection, og lavere baggrundsstøj.
Selvom chip-exo er mere teknisk udfordrende at mestre end chip-seq, er det i vid udstrækning vedtaget som undersøgelser har til formål at få unikke ultra indsigt høj opløsning ved hjælp af forskellige biologiske systemer 3-8. Faktisk har chip-exo med held været anvendt til bakterier, gær, mus, rotte, og humane cellekulturer. Som bevis på princippet blev chip-exo oprindeligt brugt til at identificere den præcise bindende motiv for en håndfuld af gær transskription faktorer 2. Teknikken blev også anvendt i gær til at undersøge organiseringen af transkription pre-initieringskompleks, og at dechifrere subnucleosomal struktur af forskellige histoner 9,10. For nylig vi gearede chip-exo at løse tilstødende TFIIB og Pol II bindende begivenheder på humane promotorer, og viste, at udbredt divergent transkription skyldes distinkt initieringskomplekser 11.
Arbejdsgangen præsenteres her er optimeret og streamlined For mammale chip-exo (figur 1). Først lever primære eller vævskulturceller behandlet med formaldehyd for at bevare in vivo protein-DNA-interaktioner gennem en kovalent tværbinding. Cellerne lyseres og chromatin sheared til ~ 100 – 500 basepar størrelse fragmenter. Chip derefter selektivt beriger for DNA-fragmenter tværbundet til proteinet af interesse. På dette tidspunkt er chip-seq biblioteker fremstilles typisk, som i sagens natur begrænser påvisning beslutning til gennemsnitlige fragment størrelse på nogle få hundrede basepar. Imidlertid chip-exo overvinder denne begrænsning ved at trimme den venstre og højre 5 'DNA-grænserne af proteinet-DNA krydsbinding site med lambda exonuklease. Sekventeringsreaktioner biblioteker konstrueres derefter fra exonuklease fordøjet DNA som beskrevet nedenfor. De resulterende indlejrede 5'grænser udgør en in vivo fodaftryk af proteinet-DNA interaktion (figur 1, trin 14), og detekteres af high throughput sekventering. altHough chip-exo metode er mere involveret end chip-seq, overgange mellem de fleste trin kræver enkel perle vask, hvilket minimerer prøvetab og eksperimentel variabilitet. Vigtigere er det, da chip-exo er en raffineret udgave af chip-seq, enhver prøve, som er vellykket med chip-seq bør også være en succes med chip-exo.
In vivo footprinting af protein-DNA-interaktioner med chip-exo resulterer i en grundlæggende forskellige datastruktur fra chip-seq. Selvom almindelige Chip-seq opkaldere kan anvendes på chip-exo-data, for at opnå de mest præcise peak opkald anbefaler vi bioinformatiske værktøjer specifikt designet med den unikke struktur i chip-exo-data i tankerne. Disse omfatter Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla, og ExoProfiler 12-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi præsenterer en funktionel genomisk protokol til at bestemme den præcise bindende sted for kromatin interagerende proteiner i en fordomsfri, genom-dækkende måde ved nær basepar opløsning. Det mest kritiske trin for at opnå nær basepar kortlægningsopløsning er exonukleasebehandling af chip-beriget DNA mens immunopræcipitatet forbliver på magnetiske harpiks. Tilsyneladende kunne proteinkomplekser potentielt blokere in vivo footprinting af enhver given underenhed (fx chromatin remodeli…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Venters Lab and members of the Molecular Physiology and Biophysics Department for helpful discussions. Special thanks to Frank Pugh for his guidance, mentoring, and many insightful discussions on the nuances of ChIP-exo while I was a post-doctoral fellow in his laboratory.
Materials
| 37% formaldehyde, methanol free, 10x10ml ampules | ThermoFisher Scientific | 28908 | Section 3 |
| Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sections 4, 8 |
| Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | Section 5 |
| 15 ml polystyrene tubes | BD Falcon | 352095 | Section 5 |
| MagSepharose Protein G Xtra beads | GE Healthcare | 28-9670-66 | Section 6 |
| DynaMag-1.5ml Side Magnetic Rack | Invitrogen | 12321D | Sections 6-17, 22 |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sections 7, 22 |
| T4 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0203 | Section 9 |
| DNA Polymerase I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Section 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) | New England BioLabs | B7002 | Sections 9-11, 13, 15, 20 |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sections 9-16 |
| ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sections 9, 11, 13 |
| dNTPs | New England BioLabs | N0447 | Sections 9, 12, 19, 23 |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201 | Sections 9, 13 |
| dATP | New England BioLabs | N0440 | Sections 10, 20 |
| Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sections 10, 20 |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202 | Sections 11, 21 |
| Φ-29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269 | Sections 12, 19 |
| 10x Φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sections 12, 19 |
| Lambda Exonuclease | New England BioLabs | M0262 | Section 14 |
| 10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Section 14 |
| RecJf Exonuclease | New England BioLabs | M0264 | Section 15 |
| Proteinase K | Roche Life Science | 03115828001 | Section 16 |
| Glycogen | Roche Life Science | 010901393001 | Section 18 |
| 10x T4 Ligase Buffer | New England BioLabs | B0202 | Section 21 |
| AMPure XP (clean up) beads | Beckman Coulter | A63881 | Section 22 |
| Q5 Hot Start DNA Polymerase | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 25 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
| Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |
Riferimenti
- Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
- Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
- Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
- Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
- Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
- Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
- Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035 (2015).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339 (2016).
- Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack–a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
- Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638 (2012).
- Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
- Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156 (2014).
- Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24 (2012).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147 (2013).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).
