Qui, presentiamo un protocollo per ottenere una risoluzione vicina alla coppia di basi delle interazioni proteina-DNA. Questo si ottiene mediante trattamento esonucleasico di frammenti di DNA arricchiti selettivamente mediante immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-exo) seguita da sequenziamento ad alto rendimento.
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Articolo metodologico
Il metodo ChIP-exo: Identificazione interazioni proteina-DNA con Vicino paia di basi di precisione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è uno strumento indispensabile nel campo della epigenetica e regolazione genica che isola specifiche interazioni proteina-DNA. ChIP accoppiato ad alto rendimento sequenziamento (ChIP-seq) viene comunemente utilizzato per determinare la posizione genomica di proteine che interagiscono con cromatina. Tuttavia, Chip-Seq è ostacolata dalla risoluzione mappatura relativamente basso di diverse centinaia di paia di basi e di alta segnale di fondo. Il metodo ChIP-Exo è una versione raffinata di ChIP-Seq che migliora sostanzialmente al momento sia la risoluzione e rumore. La distinzione fondamentale della metodologia ChIP-Exo è l'incorporazione di lambda esonucleasi digestione nel flusso di lavoro di preparazione biblioteca all'impronta efficacemente sinistra e destra 5 confini 'del DNA del sito reticolazione proteina-DNA. Le librerie CHIP-exo vengono poi sottoposti ad alto rendimento sequenziamento. I dati risultanti può essere sfruttata per fornire intuizioni uniche e ultra-alta risoluzione nell'organizzazione funzionale of genoma. Qui, descriviamo il metodo ChIP-exo che abbiamo ottimizzato e semplificato per i sistemi di mammiferi e la piattaforma di sequenziamento per sintesi di nuova generazione.
Introduzione
Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è un potente metodo per studiare i meccanismi di regolazione genica da selettivamente arricchente per frammenti di DNA che interagiscono con una certa proteina nelle cellule viventi. Metodi di rilevamento di frammenti di DNA chip arricchito si sono evoluti come la tecnologia migliora, dal rilevamento di un singolo locus (standard ChIP-qPCR) per ibridazione su microarray di oligonucleotidi (Chip-chip) a high-throughput sequencing (ChIP-Seq) 1. Anche se ChIP-Seq ha visto applicazione diffusa, l'eterogeneità della cromatina e le interazioni DNA aspecifiche hanno ostacolato la qualità dei dati che porta a falsi p....
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Protocollo
Nota: Double H 2 O distillata o grado equivalente molecolare è consigliato per tutti i buffer e le reazioni miscele.
Giorno 0: Preparazione del materiale e delle cellule Harvest
1. Preparazione Buffer
- Preparare Lysis Buffer 1 - 3 (tabelle 1 - 3) e aggiungere 100 ml completa inibitore della proteasi magazzino (CPI) a 50 ml di ogni buffer appena prima dell'uso. Preparare CPI magazzino sciogliendo una compressa in 1 ml di grado molecolare H 2 O.
- Preparare ChIP Buffer (Tabelle 4 - 7). Aggiungere 100 microlitri CPI stock da 50 ml di Bloc....
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Risultati
Le seguenti figure illustrano i risultati rappresentativi del protocollo ChIP-exo qui presentata. In contrasto con metodologie tradizionali chip ss con pochi passaggi enzimatici, Chip-exo richiede undici reazioni enzimatiche in sequenza dipendenti (Figura 1). Pertanto, occorre fare attenzione ad ogni passaggio per garantire che ciascun componente di reazione viene aggiunto al rispettivo master mix di reazione. Si consiglia di generare un foglio di calcolo formule in base.......
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Discussione
Vi presentiamo un protocollo di genomica funzionale per determinare la posizione di rilegatura preciso per cromatina proteine interagenti in modo imparziale, genome-wide a risoluzione pressi coppia di basi. La fase più critica per ottenere vicino alla base risoluzione pair mappatura è il trattamento esonucleasi del DNA ChIP arricchiti mentre l'immunoprecipitato rimane sulla resina magnetica. Apparentemente, complessi proteici potrebbero potenzialmente bloccare footprinting in vivo di ogni subunità <.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Venters Lab e i membri del Dipartimento di Fisiologia Molecolare e Biofisica per le utili discussioni. Un ringraziamento speciale a Frank Pugh per la sua guida, il suo mentoring e le molte discussioni approfondite sulle sfumature del ChIP-exo mentre ero un borsista post-dottorato nel suo laboratorio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 37% formaldeide, senza metanolo, 10 fiale da 10 ml | ThermoFisher Scientific | 28908 | Sezione 3 |
| Cocktail completo di inibitori della proteasi (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sezioni 4, 8 |
| Sonicatore Bioruptor | Diagenode | UCD200 | Sezione 5 |
| Tubi in polistirene da 15 ml | BD Falcon | 352095 Sezione 5 | |
| Perline MagSepharose Protein G Xtra | GE Healthcare | 28-9670-66 | Sezione 6 |
| DynaMag-1.5 ml Rack magnetico laterale | Invitrogen | 12321D | Sezioni 6-17, 22 |
| Rotatore per mini-provette | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sezioni 7, 22 |
| DNA polimerasi T4 | New England BioLabs | M0203 | Sezione 9 |
| DNA polimerasi I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Sezione 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x tampone di reazione 2) | New England BioLabs | B7002 | Sezioni 9-11, 13, 15, 20 |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sezioni 9-16 |
| ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sezioni 9, 11, 13 |
| dNTP | New England BioLabs | N0447 | Sezioni 9, 12, 19, 23 |
| T4 Polinucleotide chinasi | New England BioLabs | M0201 | Sezioni 9, 13 |
| dATP | New England BioLabs | N0440 | Sezioni 10, 20 |
| Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sezioni 10, 20 |
| T4 DNA ligasi | New England BioLabs | M0202 | Sezioni 11, 21 |
| φ-29 DNA polimerasi | New England BioLabs | M0269 | Sezioni 12, 19 |
| 10x φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sezioni 12, 19 |
| Esonucleasi Lambda | New England BioLabs | M0262 | Sezione 14 |
| 10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Sezione 14 |
| RecJf Esonucleasi | New England BioLabs | M0264 | Sezione 15 |
| Proteinasi K | Roche Life Science | 03115828001 | Sezione 16 |
| Glicogeno | Roche Life Science | 010901393001 | Sezione 18 |
| 10x T4 Ligasi Buffer | New England BioLabs | B0202 | Sezione 21 |
| AMPure XP (pulizia) perline | Beckman Coulter | A63881 | Sezione 22 |
| Q5 Avviamento a caldo DNA polimerasi | New England BioLabs | M0493 | Sezione 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x tampone PCR) | New England BioLabs | B9027 | Sezione 23 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Sezione 25 |
| Qubit Fluorimetro | Invitrogen | Q33216 | Sezione 26 |
| Tubi Qubit ottici trasparenti | Invitrogen | Q32856 | Sezione 26 |
| Qubit dsDNA Kit di test ad alta sensibilità | Invitrogen | Q32851 | Sezione 26 |
Riferimenti
- Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (20....
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Ristampe e permessi
