Den foreliggende protokollen beskriver hvordan Western blotting og immunocytokjemi kombinert med hemming av lysosomale enzymer kan anvendes for å demonstrere den nedregulering av ciliær neurotrofisk faktor-reseptor-α (CNTFRα), som føres ved interaksjonen mellom cytokin-lignende faktor-1 (CLF-1 ) og endocytic reseptoren sorLA.
Den heterodimere cytokin Cardiotrophin lignende cytokin: cytokin-lignende Factor-1 (CLC: CLF-1) er rettet mot glykosylfosfatidylinositol (GPI) -anchored CNTFRα å danne en trimere kompleks som senere rekrutterer glykoprotein 130 / leukemi hemmende faktor reseptor-β (gp130 / LIFRβ) for signalering. Både CLC og CNTFRα er nødvendige for signalering, men hittil CLF-1 har bare vært kjent som en antatt tilrettelegger for CLC sekresjon. Imidlertid har det nylig blitt vist at CLF-en inneholder tre bindingssteder: en for CLC; en for CNTFRα (som kan fremme sammenstillingen av trimere kompleks); og en for endocytic reseptoren sorLA. Det sistnevnte område gir høy affinitetsbinding av CLF-1, CLC: CLF-1, så vel som den trimere (CLC: CLF-1: CNTFRα) -kompleks for å sorLA, og i sorLA-uttrykkende celler de løselige ligander CLF-1 og CLC : CLF-en blir raskt tatt opp og internalisert. I celler co-uttrykker CNTFRα og sorLA, CNTFRα binder første CLC: CLF-en for å danneen membran-assosiert trimere kompleks, men det kan også kobles til sorLA via gratis sorLA-bindingssetet i CLF-en. Som et resultat, CNTFRα, som ikke har kapasitet til endocytose av seg selv, er rykket sammen og internaliseres av sorLA endocytose av CLC: CLF-1.
Den nåværende protokollen beskriver de eksperimentelle prosedyrer som brukes til å demonstrere i) sorLA-mediert og CLC: CLF-en-avhengige nedregulering av overflatemembran CNTFRα uttrykk; ii) sorLA endocytose og lysosomal målretting av CNTFRα; og iii) den senkede cellulær respons overfor CLC: CLF-1-stimulering ved sorLA-mediert nedregulering av CNTFRα.
CLC og CLF-en utgjør de to subenheter av heterodimere cytokin CLC: CFL-en 1-3. For signal induksjon, CLC: CLF-1 første målene den CNTFRα, dens primære og GPI-forankret reseptoren, for å danne en membran-bundet trimere kompleks. CLC: CLF-1: CNTFRα kompleks senere rekrutterer gp130 / LIFRβ som formidler transsignalering via Janus Kinase / Signal Givere og aktivatorer av transkripsjon 3 (JAK / STAT3) pathway 4. Mus mangelfull i en hvilken som helst av de tre subenheter viser en og samme fenotype og dør innen 24 timer etter fødselen på grunn av et redusert antall ansiktsnerveceller og utilstrekkelig diende 5-8. Funn i mennesker også understreke den funksjonelle sammenhengen i de tre subenheter. Dermed menneskelige mutasjoner (homozygote eller sammensatte) forårsaker dysfunksjon av CLC: CLF-en eller CNTFRα, alle resultat i den såkalte kuldeindusert svetting / Crisponi syndrom, en tilstand karakterisert ved symptomer som impairød dier og svelge, ulike dysmorphic funksjoner, temperatur pigger, og paradoksalt og perfuse svett ved lave temperaturer 9-11.
In vitro, er både nødvendig og tilstrekkelig for interaksjon med gp130 / LIFRβ og induksjon av signalering i celler 12 kombinasjonen av CLC og CNTFRα. Rollen til CLF-1 på den annen side er mindre klar. Det er ikke direkte involvert i signalering, og har lenge vært ansett som et vedlegg som hovedsakelig tjener til å lette celle utskillelsen av CLC en. Men nyere funn viser at CLF-en har flere og flere viktige funksjoner implicating både signal og omsetning av CLC og CNTFRα. Dermed ser det ut til at CLF-en inneholder tre uavhengige bindingssteder: en for sin velkjente binding til CLC; en som formidler direkte binding til CNTFRα; og en tredje (høy affinitet) nettsted for interaksjon med endocytic reseptoren sorLA. Som både CLC og CLF-en virke & #160, for å målrette CNTFRα med en betydelig lavere affinitet enn CLC: CLF-1-komplekset, er det tenkelig at CLF-1 (via dens CNTFRα-bindingssetet) fremmer samlingen av CLC og CNTFRα og derved letter signale 13.
CLF-en interaksjon med sorLA, den viktigste saken for den foreliggende presentasjon, spiller en helt annen rolle. SorLA er en av de fem type 1-reseptorer som utgjør Vps10p-domenet reseptor familien 14. Den uttrykkes i en rekke forskjellige vev, men spesielt i hjernen og neuronale vev 15. I likhet med de andre familiemedlemmer sorLA bærer en N-terminale ligandbindende Vps10p-domene, men i tillegg omfatter den også andre domenetyper, inkludert ligand-bindende elementer som finnes i medlemmer av low-density lipoprotein receptor familie 15. Dens cytoplasmatiske hale samhandler med flere adapter proteiner, f.eks adapter protein-1 og -2, og sorLA formidler effektive endocytoser i tillegg til intracellulær sortering og transport av bundne proteiner 16-18. Den Vps10p-domene består av en stor ti blader β-propell 19,20, som binder en rekke urelaterte ligander inkludert CLF-en (men spesielt, ikke CLC) 13. Bindingssetet i CLF-en er tilgjengelig selv etter dannelsen med CLC og CNTFRα kompleks som betyr at sorLA binder ikke bare gratis CLF-en, men også CLC: CLF-en og trimere komplekse CLC: CLF-1: CNTFRα 13. SorLA formidler hurtig endocytose av CLF-1 og CLC: CLF-en, men disse er oppløselige proteiner, mens CNTFRα er festet til overflatemembranen ved et GPI-ankeret. Spørsmålet er derfor om bindingen av CLC: CLF-1: CNTFRα tillater sorLA å internal hele komplekset og derved å endre overflatemembranen ekspresjon av CNTFRα (og den påfølgende celle mottakelighet for CLC: CLF-1 signal induksjon), og / eller omsetningen av CNTFRα.
Forsøkene som beskrives i den foreliggendeRapporten ble laget for å avklare disse spørsmålene:
Har sorLA megle CLC: CLF-en-avhengige nedregulering av overflatemembran CNTFRα? For å klargjøre dette, ble det først prøvde å bestemme omsetningen av CNTFRα (i fravær og nærvær av sorLA) ved hjelp av metabolske merking og puls-chase eksperimenter som er beskrevet i 21. Imidlertid har forsøk på å merke CNTFRα ved anvendelse av en blanding av [S 35] cystein og [S 35] metionin viste dårlig inkorporering av radioaktivitet. Dette antydet en meget lav grad av ny-syntese, som etter all sannsynlighet vil være ute av stand til å kompensere for en plutselig og betydelig tap av reseptorer. For å avgjøre om CNTFRα ble nedregulert når sammen via CLC: CLF-en til sorLA, ble det derfor besluttet bare å måle (ved hjelp av Western blotting) den totale mobilnettet pool av CNTFRα før og etter eksponering for CLC: CLF-en – og å sammenligne resultater i celler transfektert eller ikke transfektert medsorLA.
Har sorLA målrette CNTFRα til lysosomer? For å besvare dette spørsmålet, lokalisering av CNTFRα – internalisert via sin CLC: CLF-1-mediert binding til sorLA – ble undersøkt ved hjelp av immunocytokjemi og merking med antistoffer rettet mot CNTFRα og sen-endosomet / lysosome markør lysosomal-forbundet Membrane Protein 1 (LAMP-1). Eksperimentet ble utført på celler som behandles, så vel som ubehandlet med inhibitorer av lysosomale enzymer. Tanken var selvsagt at hvis CNTFRα ble nedbrutt i lysosomer, ville celler behandlet med enzym-inhibitorer frem CNTFRα-farging akkumuleres i lampe-1-positive vesikler, mens ubehandlede celler ville vise liten eller ingen farging for CNTFRα.
Har CNTFRα downregulation senke cellulær respons til CLC: CLF-en stimulering? Den trimere kompleks bestående av CLC, CLF-en, og CNTFRα signaler via gp130 / LIFRβ heterodimer med JAK / STAT3sti. Følgelig til kapasiteten på cellene svare på CLC: CLF-en signale på nedregulering av CNTFRα ble utforsket av Western blot påvisning og kvantifisering av fosfor-STAT3 (pSTAT3) / total STAT3 nivå i sorLA transfektanter.
Protokollen er beskrevet her kan brukes for spesifikt å påvise den sorLA-mediert CLC: CLF-1-avhengige nedregulering og lysosomal målretting av CNTFRα, så vel som den tilhørende svekket respons på CLC: CLF-1 stimulering.
Den HEK293 cellelinje er godt egnet for denne protokollen, som de har bare en mindre endogen uttrykk for CNTFRα og sorLA, er lett å transfektere, hurtig gp130 / LIFRβ, og har en stor celle kroppen, som er egnet for immunocytochemistry. Men i teorien alle cellelinje med tilsvarende egenskaper skal fungere også.
Protokollen har to kritiske trinn. Det første gjelder trinn 2.3, i hvilken leu / pep medium må byttes ut omtrent hver 6 time i 24 timer. Unnlatelse av å gjøre det kan resultere i aktive lysosomale enzymer og mindre eller ingen påviselig opphopning av protein i lysosomene. Den andre kritiske trinn (3.4) gjelder vasking på pre-inkubasjon med CLC: CLF-en. Det er imtig for å fjerne eventuelt ubundet ligand, og å tillate cellene tid å gjenopprette (forts unngå stimulering) i usupplert DMEM (blank medium). Dette vil sikre en lav bakgrunnsnivået av pSTAT3 under den etterfølgende re-stimulering med CLC: CLF-1 (trinn 3.5).
Spesielt, figur 6 viser at den cellulære respons (pSTAT3) avtar i parallell med sorLA-mediert nedregulering av CNTFRα. Det skal understrekes imidlertid at selv om en redusert respons er i overensstemmelse med (og som kan forventes ved) en reduksjon av CNTFRα bassenget, er det ikke påvise at den lave CNTFRα uttrykket alene står for den reduserte cellulære respons. Således endringer – som følge av pre-stimulering eller transfeksjon – i en hvilken som helst av de funksjonelle elementene i signalveien oppstrøms til pSTAT3 kan ha bidratt til den endrede respons.
Det grunnleggende konsept av protokollen er ikke begrenset til denne spesiLar receptor systemet. (. Dvs. en annen cellelinje, andre antistoffer, andre ligander, etc) ved modifisering av protokollen kan den brukes til å bestemme den ligand-induserte nedregulering av andre reseptorer i tillegg – uavhengig av sorLA's engasjement. Imidlertid bør det bemerkes at analysen av reseptor-nedregulering ved Western-blotting er hovedsakelig egnet for reseptorer, f.eks GPI-forankrede reseptorer, som utviser en langsom omsetning og en lav grad av ny syntese i ikke-stimulerte celler. Således, i-reseptorer som viser et høyt nivå av ny-syntese, ligand-induserte nedregulering kan kompenseres for ved syntese av nye reseptorer. Under disse omstendigheter kan nedregulering av reseptoren bassenget i stedet bli bestemt ved hjelp av metabolske merking og puls-chase eksperimenter som er beskrevet i 21. Alternativt joderte antistoffer (fortrinnsvis Fc-fragmentene) som ikke interfererer med reseptorbinding kan brukes til å "tag" den ectodomain av recepteller, og det forventede nedregulering kan deretter bestemmes ved radioaktiv telling av cellepellet og medium.
For logistikk grunnene til at vi tilført våre celler med en CNTFRα konstruere bærer en Myc-tag, og i denne protokoll en mus anti-myc antistoffet ble benyttet for Western blot-påvisning av reseptoren. I motsetning til dette ble en geit anti-CNTFRα antistoff som brukes for immunocytokjemi og dobbeltmerking som LAMPE-1 ble detektert med et museantistoff – og selvsagt bruk av to primære museantistoffer vil resultere i uspesifikk (overlappende) farging med sekundære antistoffer. Legg merke til at siden geite-anti-CNTFRα fungerer også i Western blotting (ikke vist), protokollen kan lett modifiseres og anvendes på celler transfektert med umerket CNTFRα.
Endelig har det nylig vist at også endocytic reseptoren sortilin binder CLC: CLF-en med høy affinitet 22. Således er det tenkelig at sortilin, i likhetsorLA, sammenkoblinger til CLC: CNTFRα via CLF-1 og er i stand til å formidle endocytose og lysosomal målretting av CNTFRα også. Bruke sortilin istedenfor sorLA, kan den nåværende protokollen brukes til å avklare dette spørsmålet.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements.
Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
Dulbecco Modified Eagle´s Medium | Lonza | BE12-604F/U1 | |
Fetal bovine serum | Thermo Scientific | 10270106 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
Dulbecco Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30028.02 | |
CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
LDS sample Buffer (4X) | Novex | NP0007 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
4% paraformaldehyde | VWR | 97,135,000 | |
Saponin | Sigma | S7900-100G | |
Mounting Media | Dako | S3023 |