लाइव इमेजिंग अध्ययन करने के लिए taxane प्रतिरोधी स्तन कैंसर में microtubule गतिशील अस्थिरता
Summary
In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.
Abstract
Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs’ long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics.
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged α-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.
Introduction
स्तन कैंसर से मृत्यु का प्रमुख कारण मेटास्टेसिस 1, 2 के माध्यम से है। ऐसे docetaxel और Paclitaxel के रूप में Taxanes, वर्तमान में पहली पंक्ति के रूप में metastatic स्तन कैंसर 2, 3, 4, 5, 6 के उपचार में regimens किया जाता है। वे microtubule को लक्षित एजेंट (एमटीए) कि microtubule गतिशीलता को बाधित के एक समूह का हिस्सा हैं। हालांकि, उपचारात्मक चिकित्सा में taxanes उपयोग करने के लिए सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक कैंसर की कोशिकाओं में taxane प्रतिरोध है, जो रोग की पुनरावृत्ति 7 की ओर जाता है का विकास है। ड्रग प्रतिरोध metastatic स्तन कैंसर 7 के साथ मरीजों के बीच सभी मौतों के 90% से अधिक के लिए खातों।
सूक्ष्मनलिकाएं α- और β ट्यूबिलिन heterodimers के polymerization द्वारा गठित कर रहे हैंवर्ग = "xref"> 8, 9। microtubule गतिशीलता के सटीक विनियमन सेल ध्रुवीकरण, कोशिका चक्र प्रगति, intracellular परिवहन, और संकेतन सेल सहित कई सेलुलर कार्यों के लिए महत्वपूर्ण है। सूक्ष्मनलिकाएं और उनकी गतिशीलता का अनियंत्रण सेल समारोह को बाधित और कोशिका मृत्यु 10, 11 में परिणाम होगा। कैसे वे इस अनियंत्रण कारण के आधार पर, एमटीए दवाओं या तो microtubule स्थिर एजेंट (यानी, taxanes) या microtubule-destabalizing एजेंट (यानी, Vinca alkaloids या colchicine साइट पर बाध्यकारी एजेंट) 20 के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। Microtubule बड़े पैमाने पर अपने विपरीत प्रभाव के बावजूद, एक पर्याप्त मात्रा में, दोनों वर्गों कैंसर की कोशिकाओं को microtubule गतिशीलता 21 पर उनके प्रभाव के माध्यम से मार सकते हैं।
Taxanes microtubule धुरी 12 स्थिर द्वारा मुख्य रूप से कार्य करते हैं, के लिए अग्रणीगुणसूत्र misalignment। धुरी विधानसभा चौकी (सैक) के बाद सदा सक्रियण बँटवारा में सेल गिरफ्तारी। लंबे समय तक mitotic गिरफ्तारी तो apoptosis 13, 14 का कारण बनता है। Taxane β ट्यूबिलिन 8, 15, जो इकट्ठे tubulin 16 में ही मौजूद है पर taxane बाध्यकारी साइट के माध्यम से सूक्ष्मनलिकाएं के साथ सूचना का आदान प्रदान।
Taxane प्रतिरोध के लिए एकाधिक तंत्र, 17 9 प्रस्तावित किया गया है। ये तंत्र दवा तपका प्रोटीन और taxane-विशिष्ट प्रतिरोध 5, 9, 18, 19 की overexpression के कारण दोनों को सामान्य बहुऔषध प्रतिरोध में शामिल हैं। उदाहरण के लिए, taxane प्रतिरोधी कैंसर की कोशिकाओं को अभिव्यक्ति और कुछ β-टब के समारोह में परिवर्तित हो सकता हैUlin 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23 isotypes। एक विवो विधि का उपयोग microtubule गतिशील अस्थिरता को मापने के लिए करके, हम बताते हैं कि, जब गैर-प्रतिरोधी, माता पिता का MCF 7 सीसी कोशिकाओं की तुलना में 17, docetaxel प्रतिरोधी MCF 7 TXT कोशिकाओं की गतिशीलता microtubule docetaxel उपचार के लिए असंवेदनशील हैं।
बेहतर एमटीए के समारोह और कैंसर कोशिकाओं में taxane-प्रतिरोध की सटीक व्यवस्था को समझने के लिए, यह microtubule गतिशीलता को मापने के लिए आवश्यक है। यहाँ, हम ऐसा करने का एक विवो विधि की रिपोर्ट। कोशिकाओं में GFP टैग tubulin की अभिव्यक्ति के साथ संयोजन में रहते इमेजिंग का उपयोग करके, हम MCF 7 TXT और साथ MCF 7 सीसी कोशिकाओं और वाई के microtubule गतिशीलता उपाय कर सकते हैंthout docetaxel उपचार। परिणाम हमें और अधिक प्रभावी दवाओं है कि taxane प्रतिरोध पर काबू पाने कर सकते हैं डिजाइन कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इन विट्रो में और vivo में: वहाँ दो प्रमुख तरीके microtubule गतिशील अस्थिरता को मापने के लिए कर रहे हैं। इन विट्रो विधि में, शुद्ध tubulin कंप्यूटर बढ़ाया समय चूक अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी के स?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research is supported by funding from CBCF (to ZW).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
| 22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| 6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |
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