Articolo metodologico

Istituzione di cellule proliferativa tetraploide da non trasformate fibroblasti umani

DOI:

10.3791/55028

⸱

8 gennaio 2017

 , 
1Division of Morphological Science, Biomedical Research Center, Saitama Medical University, 2Department of Pathology, International Medical Center, Saitama Medical University

In questo articolo

Sommario

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Sebbene le cellule poliploidi proliferative siano necessarie per analizzare l'instabilità cromosomica delle cellule poliploidi, creare tali cellule da cellule umane non trasformate non è facile. Il presente rapporto descrive procedure relativamente semplici per stabilire cellule tetraploidi proliferative prive di una popolazione diploide da fibroblasti umani normali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule poliploidi (per lo più tetraploidi) sono spesso osservate nelle lesioni preneoplastiche dei tessuti umani e la loro instabilità cromosomica è stata considerata responsabile della carcinogenesi in tali tessuti. Sebbene le cellule poliploidi proliferative siano necessarie per analizzare l'instabilità cromosomica delle cellule poliploidi, la creazione di tali cellule da cellule umane non trasformate è piuttosto impegnativa. L'induzione della tetraploidia da parte di agenti chimici di solito si traduce in una miscela di popolazioni diploidi e tetraploidi, e la maggior parte degli studi ha impiegato la selezione o il clonaggio cellulare attivato dalla fluorescenza limitando la diluizione per separare le cellule tetraploidi da quelle diploidi. Tuttavia, queste procedure richiedono tempo e laboriose. Il presente rapporto descrive un protocollo relativamente semplice per indurre cellule tetraploidi proliferative da fibroblasti umani normali con una contaminazione minima da parte di cellule diploidi. In breve, il protocollo comprende le seguenti fasi: arresto delle cellule in mitosi mediante demecolcina (DC), raccolta di cellule mitotiche dopo averlo scosso, incubazione delle cellule raccolte con DC per altri 3 giorni e incubazione delle cellule in terreno privo di farmaci (riprendono la proliferazione come cellule tetraploidi entro diversi giorni). A seconda del tipo di cellula, la raccolta delle cellule mitotiche mediante scrollandosi potrebbe essere omessa. Questo protocollo fornisce un metodo semplice e fattibile per stabilire cellule tetraploidi proliferative da fibroblasti umani normali. Le cellule tetraploidi stabilite con questo metodo potrebbero essere un modello utile per studiare l'instabilità cromosomica e il potenziale oncogenico delle cellule umane poliploidi.

Introduzione

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Poliploidia è stata osservata non solo in tessuti specializzati di specie di mammiferi, ma anche in una varietà di condizioni patologiche, come il cancro e malattie degenerative. Poliploidi (per lo più tetraploide), le cellule sono spesso osservate nelle lesioni preneoplastiche di tessuti umani, come l'esofago 1,2 o squamose lesioni intraepiteliali di Barrett della cervice 3,4, e sono stati considerati per essere la fonte di cellule aneuploidi maligne in quei tessuti 5 , 6. Sebbene si suggerisce che la conversione di tetraploide di cellule aneuploidi potrebbe essere un evento cruciale nelle prime fasi della tumorigenesi, i meccanismi coinvolti in questo processo non sono pienamente compresi. Questo in parte perché nessun modello in vitro è stato disponibile dove non trasformate cellule umane poliploidi possono propagarsi.

Alcuni ricercatori hanno indotto tetraploidia in cellule epiteliali umane non trasformate attraverso la generazione di cellule binucleate di inhibiting cytokinesis 7-9. In questo metodo, tuttavia, le cellule diploidi inutili devono essere eliminate mediante fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) 7,8 o la clonazione limitando la diluizione 9. Dato che queste procedure sono laboriose e non facile da eseguire, i metodi più semplici per stabilire le cellule non trasformate tetraploide si desiderano per la ricerca in questo campo.

Nella presente relazione, si descrive un protocollo per stabilire le cellule proliferative tetraploide da fibroblasti umani normali o fibroblasti umani telomerasi-immortalata da procedure relativamente semplici. Le procedure vengono utilizzate mandrino veleno demecolcine (DC) per arrestare le cellule diploidi in mitosi, e le cellule mitotiche raccolti da scrollarsi di dosso sono ulteriormente trattati con DC. cellule mitotiche diploidi trattate con corrente continua per tempo prolungato convertire in cellule G1 tetraploide, e queste cellule proliferano le cellule come tetraploide dopo l'arresto della crescita per diversi giorni dopo la rimozione di droga. Questo protocollo prevedeun metodo efficiente per la creazione di un modello utile per studiare la relazione tra il cromosoma instabilità e il potenziale oncogeno di cellule umane poliploidi.

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Protocollo

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Cultura 1. cellulare

  1. Ottenere le cellule per indurre tetraploidia. Fino ad oggi è stato confermato che questa tecnica può essere applicata alle linee cellulari di fibroblasti umani TIG-1, BJ, IMR-90 e telomerasi immortalizzate TIG-1 (TIG-HT).
  2. Crescere le cellule in terreno minimo essenziale con modificazione α o qualsiasi altro mezzo di coltura cellulare adatto per il tipo di cellula da studiare supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino inattivato al calore (FBS) incubando in un 5% (v / v) di CO 2 nell'atmosfera a 37 ° C. cellule di passaggio ogni 3 o 4 giorni di non superare la densità subconfluenti.
    NOTA: livello di raddoppio della popolazione (PDL) deve essere calcolato di volta in volta a passaging per valutare la crescita delle cellule e l'età delle cellule. PDL può essere calcolato dal numero di cellule seminate in una piastra (N1) e il numero di cellule raccolte al successivo passaging (N2) mediante la seguente formula (X è l'iniziale PDL). PDL = X + (log N1 - N2 log) / log 2

2. Induzione e Establishment di cellule tetraploidi da diploidi fibroblasti

  1. Indurre tetraploidia senza shake-off.
    NOTA: Alcuni ceppi di cellule (ad esempio TIG-1) può diventare quasi completamente tetraploide dal trattamento continuo con demecolcine (DC) come segue.
    1. cellule passaggio nella uno o due piatti di 100 mm il giorno prima del trattamento per indurre tetraploidia. Di solito, preparare 5 x 10 5 a 1 x 10 6 cellule per piatto per l'induzione delle cellule tetraploidi.
    2. Il trattamento di cellule in crescita esponenziale con mezzo contenente 0,1 mg / ml DC per 4 giorni.
    3. Sostituire DC contenenti media con terreno privo di droga e incubare cellule in un 5% (v / v) di CO 2 atmosfera a 37 ° C. Le cellule di solito riprendono proliferazione entro 1 settimana.
  2. Indurre tetraploidia con shake-off.
    NOTA: La maggior parte delle cellule diventano una miscela di popolazioni diploidi e tetraploidi come risultato del semplice trattamento con DC sopra descritto (2.1). Pertanto, alcune modifiche della pROCEDURA per eliminare sono necessarie una popolazione diploide come segue (Figura 1).
    1. cellule Passage in diverse T75 Borraccie il giorno prima del trattamento per indurre tetraploidia. Solitamente, preparare almeno 5 x 10 6 cellule (1 x 10 6 cellule per pallone) per l'induzione di cellule tetraploidi.
    2. Il trattamento di cellule in crescita esponenziale con mezzo contenente 0,1 mg / ml DC per 16 - 18 h per arrestare le cellule in mitosi. Il tempo necessario per arrestare le cellule in mitosi può dipendere da cellule bersaglio e deve essere determinato da esperimenti preliminari per ottenere il maggior numero di cellule in mitosi possibile. Ad esempio, le cellule che crescono più lenti devono essere trattati con DC per un tempo più lungo di cellule in crescita più veloce.
      NOTA: Se le cellule vengono trattate per troppo tempo in questa fase, potrebbero subire lo slittamento mitotico e aderire alla superficie piatto, rendendo impossibile per raccogliere le cellule in mitosi di shake-off nella fase successiva.
    3. Raccogliere le cellule in mitosi DC-arrestati con il metodo shake-off, in which cellule mitotiche liberamente aderito sono raccolti da un leggero scuotimento di flaconi e lavaggio con media seguita da centrifugazione (300 xg, 5 min). Contare il numero di cellule in modo appropriato in questa fase.
    4. Reseed cellule mitotiche raccolti in capsule di Petri da 60 mm e il trattamento di cellule con 0,1 mg / ml DC per altri 3 giorni. Seed più di 1 x 10 6 cellule mitotiche per piatto, perché meno del 10% delle cellule può sopravvivere a questo trattamento.
    5. Sostituire DC contenenti media con media libera dalla droga e aspettare che le cellule a riprendere la proliferazione, che di solito si verifica entro 1 settimana.
  3. cellule di passaggio in modo simile alle cellule diploidi originali.

3. Esame del DNA Ploidia

NOTA: Questa è una procedura consolidata e un manuale tecnico deve essere affidata a procedure dettagliate e suggerimenti tecnici.

  1. Celle di raccolta (5 x 10 5 - 1 x 10 6) dalle cellule incubazione con una soluzione concontenente 0,05% tripsina e 0,02% EDTA per 10 min a 37 ° C, e neutralizzare tripsina da medium contenente 10% FBS.
  2. Centrifugare le cellule a medio e lavarli risospendendo in 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), seguita da centrifugazione (300 xg, 5 min).
  3. Preparare cellule per analisi del DNA da uno dei seguenti due metodi
    1. Un metodo per analizzare le cellule non fissate 10
      NOTA: Questo metodo può essere eseguita utilizzando un kit disponibile in commercio per l'analisi del ciclo cellulare. I campioni preparati con questo metodo dovrebbero essere analizzati immediatamente, perché le cellule non sono fissi nella procedura e colorate nuclei diventeranno danneggiato nel corso del tempo.
      1. Lavare le cellule con 40 mm tampone citrato contenente 250 mm di saccarosio. Successivamente il trattamento di cellule con 250 ml di 0,1% (v / v) Nonidet P40 e 30 mg / ml di tripsina in 200 ml di 40 mM tampone citrato contenente 250 mM di saccarosio per 10 min a temperatura ambiente.
      2. Aggiungere 200 ml di 0,5 mg / ml inh tripsinacellule ibitor e 0,1 mg / ml RNasi A a 40 mm tampone citrato contenente 250 mm di saccarosio, e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
      3. Aggiungere 200 ml di 0,4 mg / ml di ioduro di propidio (PI) in tampone citrato 40mM, contenente 250 mM di saccarosio, e incubare le cellule per 10 min a temperatura ambiente per colorare nuclei cellulari.
    2. Un metodo per analizzare cellule fissate
      1. Fissare le cellule con 80% etanolo sospendendo cellule in 1 ml di PBS, aggiungere 4 ml di EtOH 100% goccia a goccia sotto agitazione la sospensione cellulare e lasciandolo a temperatura ambiente per 30 min. Le cellule in questo fissativo possono essere conservati a -20 ° C per diverse settimane.
      2. Lavare le cellule da essi risospendere in 5 ml di PBS seguita da centrifugazione (300 xg, 5 min). Trattare cellule con 0,5 mg / ml RNasi A e macchiare con 50 ug / ml di ioduro di propidio (PI) (475 ml di 0,5 mg / ml RNasi A e 25 ml di 1 mg / mL PI) per 30 min a temperatura ambiente.
  4. Analizzare contenuto di DNA di tegli cellule utilizzando un citofluorimetro con un laser 488 nm e filtro del canale rosso (passare lungo> 610 nm). Analizzare un campione di riferimento preparata da cellule diploidi originali allo stesso tempo di valutare ploidia delle cellule bersaglio.
    1. In alternativa, aggiungere perline standard di fluorescenza per valutare il rapporto tra intensità di fluorescenza delle cellule diploidi contro le perline. Utilizzare il 'altezza degli impulsi di larghezza di impulso contro' opzione del citofluorimetro di discriminare tra cellule tetraploide singole e gruppi di cellule diploidi 11.

4. Esame dei Conti cromosomiche e analisi del cariotipo

NOTA: Queste sono tutte le procedure consolidate e un manuale tecnico o di protocolli del produttore dovrebbero essere indicati per le procedure dettagliate e suggerimenti tecnici.

  1. Il trattamento di cellule in crescita esponenziale con 0,1 mg / ml DC per 4 ore per arrestare le cellule in metafase.
  2. Preparare vetrini cromosomiche.
    1. Celle di raccolta (almeno 5 x 10 5 cellule) per tripsinizzazione e sospendere in mezzo contenente FBS.
    2. Centrifugare le cellule in terreno (300 xg, 5 min) e trattare con soluzione ipotonica (5 mL di 0,075 M KCl) a 37 ° C per 10 min.
    3. Fissare e di sospendere le cellule in fissativo di Carnoy (metanolo: acido acetico = 3: 1).
    4. Stendere le cellule su un vetrino facendo cadere un piccolo volume (25 - 35 ml) di sospensione cellulare. potrebbero essere necessarie misure aggiuntive, come l'esposizione al vapore caldo per migliorare cromosoma diffusione.
  3. Cellule colorare per i conteggi cromosomici o analisi del cariotipo o multicolore ibridazione in situ fluorescente (mFISH).
    1. conta cromosomiche.
      1. cellule macchia con soluzione Giemsa 5% (o 5 mg / mL PI contenente 0,5 mg / ml RNasi A per microscopia a fluorescenza) per 15 - 20 min.
      2. fotografare digitalmente almeno 50 cellule in metafase.
      3. Contare il numero dei cromosomi per cella utilizzando un softwa analisi delle immaginire dopo la separazione manuale di toccare e sovrapponendo i cromosomi utilizzando un software di fotoritocco. Anche se il numero dei cromosomi può essere segnata manualmente, si consiglia di punteggio computerizzato.
    2. analisi del cariotipo
      NOTA: Questa analisi deve essere eseguita da un tecnico qualificato o di una società di professionisti.
      1. Cellule Stain secondo una tecnica G-banding standard di 12.
      2. Analizzare i cromosomi per fare karyograms standard da 12.
    3. mFISH
      NOTA: Questo passaggio è facoltativo e dovrebbe essere eseguita se necessario.
      1. Cellule macchia con sonde FISH multicolore di cromosomi umani secondo il protocollo 13 del produttore.
      2. Analizzare i cromosomi utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri idonei e di un software per l'analisi mFISH 13.

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Risultati

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Nella nostra esperienza, cellule TIG-1 possono essere realizzati quasi completamente tetraploid per semplice trattamento continuo con 0,1 mg / mL DC per 4 giorni (Figura 2A). Al contrario, altri ceppi di fibroblasti, come BJ o IMR-90, e le cellule TIG-HT, è diventato una miscela di diploide e popolazioni tetraploidi seguito lo stesso trattamento, e l'isolamento di cellule mitotiche con il metodo shake-off è necessario durante il corso di trattamento DC (di solito 16 - 18...

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Discussione

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Un grave problema nel induzione di tetraploidia da cellule diploidi di agenti chimici, sia da inibitori Citochinesi o con inibitori del fuso, è che le cellule diventano spesso un miscuglio di popolazioni diploidi e tetraploidi, e le cellule tetraploidi devono essere separati dalle cellule diploidi. approcci più comuni per l'isolamento di una popolazione tetraploide privo di cellule diploidi utilizzano FACS o clonazione, limitando la diluizione. Tuttavia, queste procedure sono laboriosa e non facile da eseguire. In q...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario in competizione.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo la signora Matsumoto per l'assistenza tecnica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MEM-&alfa;Sigma-AldrichM8042-500ML
Tripsina-EDTASigma-AldrichT4174
FBSSigma-Aldrich172012-500ML
Soluzione di demecolina (10 μ g/mL in HBSS)Sigma-AldrichD1925-10ML
BD CycleTES Plus Kit di reagenti DNA BDBiosciences#340242Per l'esame della ploidia del DNA mediante citometria a flusso
Sonda FISH multicolore per cromosomi umani 24XCyteMetaSystems#D-0125-060-DISono necessari un set di filtri specializzati e un software per l'analisi mFISH
Sistema di imaging Isis con software mFISH necessario un kit di sonde specializzatoMetaSystems
È

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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