Raccolta di di siero e senza alimentatore staminali embrionali di topo medio-Cell condizionata per un approccio libero-Cell

Summary

Questo protocollo fornisce un metodo per la raccolta di cellule staminali embrionali di topo (Mesc) medio -conditioned (Mesc-CM) derivato dal siero (siero fetale bovino, FBS) - e di alimentazione (fibroblasti embrionali di topo, MEF) Condizioni senza glutine per una cella approccio-free. Può essere applicabile per il trattamento di invecchiamento e malattie associate invecchiamento.

Abstract

La capacità delle cellule staminali embrionali (ESC) e delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) di generare vari tipi di cellule ha aperto nuove strade nel campo della medicina rigenerativa. Tuttavia, nonostante i loro benefici, il potenziale tumorigenico delle ESC e delle iPSC è stato a lungo un ostacolo per le applicazioni cliniche. È interessante notare che è stato dimostrato che le ESC producono diversi fattori solubili che possono promuovere la rigenerazione dei tessuti e ritardare l'invecchiamento cellulare, suggerendo che le ESC e le iPSC possono essere utilizzate anche come metodo di intervento privo di cellule. Pertanto, il metodo per la raccolta di terreno condizionato con cellule staminali embrionali di topo (mESC) (mESC-CM) con una contaminazione minima dei componenti del siero (siero fetale bovino, FBS) e delle cellule di alimentazione (fibroblasti embrionali di topo, MEF) è stato molto richiesto. Qui, il presente studio dimostra un metodo ottimizzato per la raccolta di mESC-CM in condizioni prive di siero e alimentatore e per la caratterizzazione di mESC-CM utilizzando letture multiple associate alla senescenza. Questo protocollo fornirà un metodo per raccogliere fattori secretori puri specifici per mESC senza contaminazione del siero e dell'alimentatore.

Introduction

L'obiettivo di questo protocollo è quello di raccogliere il mouse sulle cellule staminali embrionali (Mesc) medio -conditioned (Mesc-CM) da condizioni di coltura di siero e privo di alimentazione e per caratterizzare le sue funzioni biologiche.

In generale, le cellule staminali embrionali (ESC) hanno un grande potenziale per la medicina rigenerativa e terapia cellulare per la loro pluripotenza e la capacità di auto-rinnovamento ^1-3. Tuttavia, il trapianto diretto di cellule staminali ha diverse limitazioni, come rigetto immunitario e la formazione del tumore ^4,5. Pertanto, un approccio libero-cella può fornire un....

Protocol

NOTA: Uno schema del sierica- e protocollo di raccolta CM-free alimentatore è mostrato in Figura 1.

1. Materiali (Preparazione del MEF, Medium, piatti, e Solutions)

1. Preparare 500 ml di terreno alla cultura i MEF. Supplemento Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) con 10% FBS (ESC qualità), 50 unità / ml di penicillina, 50 mg / ml di streptomicina.
2. Isolare MEF da embrioni a seguito di un protocollo di routine consolidata ¹³ e mantenerli in media MEF.
3. Preparare 500 ml di terreno alla cultura i mESCs. DMEM è completato con 15% FBS e 2 mM L-glutammina, 100 mM aminoacidi non essenziali (NEAA), 100 mM β-me....

Results

In origine, mESCs sono mantenuti su un alimentatore MEF in media Mesc con FBS e altri integratori (Figure 1A e 2A). CM è stato raccolto da mESCs a ridotto siero media senza uno strato alimentatore, FBS, o altri supplementi (figure 1B e 2B). Questa condizione la cultura ci permette di raccogliere Mesc specifico mezzo condizionato senza potenziale contaminazione da fattori dall'alimentatore, FBS, o altri supplementi. Il me.......

Discussion

Per la collezione di successo di di siero e Mesc-CM senza alimentatore, i seguenti suggerimenti dovrebbero essere presi in considerazione. Il fattore più critico è usando mESCs passaggio primi per la raccolta di Mesc-CM. In precedenza, è stato dimostrato che il passaggio anticipato Mesc-CM ha migliori effetti anti-invecchiamento rispetto al mESCs fine del passaggio. Stato segnalato il numero passaggio di mESCs di influenzare il loro potenziale di sviluppo ¹⁶ e ¹⁷ pluripotenza.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	#11960-044
FBS	Invitrogen	#30044333	20%, qualità cellulare ES
Penicillina e streptomicina	Invitrogen	#15140	50 unità/ml penicillina e 50  mg/ml di streptomicina
L-glutammina	Invitrogen	#25030	2  mM
Aminoacidi non essenziali (NEAA)	Invitrogen	#11140	100  µ M
β-mercaptoetanolo	Sigma	#M3148	100  µ M
Fattore inibitorio della leucemia	Millipore	#ESG1107	100 unità/ml
OPTI-MEM	Invitrogen	#22600
X-gal	Sigma	#B4252	1 mg/ml
Paraformaldeide (PFA)	Sigma	P6148	3,70%
Dimetilformammide (DMF)	Sigma	#D4551
Ferricianuro di potassio	Aldrich	#455946	5 mM
ferrocianuro di potassio	Aldrich	#455989	5 mM
NaCl	Sigma	#S7653	150 mM
MgCl2	Sigma	#M2393	2 mM
Mitomicina C	Sigma	#M4287	10  µ g/ml
di ioduro di propidio	Sigma	#P4170	50  µ g/ml
TRIzol	Ambion	#15596018
M-MLV trascrizione inversa-tasi	Promega	#M170B
Power SYBR Green PCR master mix	Biosistemi applicati	#4367659
HDF, NHDF-Ad-Der-Fibroblasti	LONZA	#CC-2511
Filtro per bottiglie	Corning	#430513	0.2 μ m