Bruk av en Monocyte ett lag Assay å evaluere Fcy Receptor-mediert Fagocytose

Summary

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis.

Abstract

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express FcγRs (e.g., FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, and FcγRIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of FcγR-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate FcγRs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out FcγR-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo FcγR-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of FcγR-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Introduction

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay originally developed to better predict blood transfusion outcomes in patients with auto- or alloantibodies to red blood cells (RBCs)^1-5. By assessing the effect of anti-RBC antibodies in mediating Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis using this in vitro assay, it is possible to predict the clinical outcome in vivo. Indeed, the MMA has been used successfully to avoid immune destruction of antibody-bound RBCs, despite the transfusion of serologically incompatible blood⁵. The typical pre-transfusion procedure for compatibility testing, also termed crossmatching, involves serological methods that include typing the patient’s blood for ABO and Rh antigens and screening for the presence of anti-RBC antibodies in the patient⁶. Blood matched for ABO/Rh is selected, and if antibodies are present, an attempt to identify them is made so that blood for transfusion can be further selected to avoid these antigens. An ideal crossmatch result occurs when all donor blood is serologically compatible with the patient’s blood, which reduces the risk of post-transfusion hemolysis⁷. However, this system falls short for the small group of patients who have become alloimmunized upon repeated transfusion or pregnancy. These patients produce alloantibodies against specific RBC antigens. Some produce antibodies to antigens of very high frequency in the general population, and thus become progressively more difficult to crossmatch^8,9. Adding to the complexity, not all alloantibodies are clinically significant; in other words, the binding of an alloantibody to RBCs detected by a serology test does not necessarily result in hemolysis when antigen-positive, incompatible blood is transfused. The MMA was originally developed to assess the potential clinical significance of serologically incompatible blood in a transfusion setting^1-5.

Since extravascular hemolysis of antibody-bound RBCs is known to be mediated by the mononuclear phagocyte system, primary monocytes/macrophages are utilized in the development of diagnostic assays. The first assay to study the interaction of monocytes, RBCs, and antibodies was published in 1975, but the sub-optimal conditions used led only to rosette formation (the binding of RBCs to the periphery of the monocyte), and no phagocytosis was observed¹⁰. Significant modifications to the assay were made by several groups, leading to an assay for which the level of phagocytosis of alloantibody-bound RBCs could be correlated to the clinical outcome of hemolysis^1-5. Recently, the optimal storage conditions of clinical samples and further optimization of assay conditions were examined to enhance the utility of a clinical MMA crossmatch using autologous patient samples¹¹.

Three other diagnostic techniques have been employed in addition to the MMA in predicting transfusion outcomes: the ⁵¹Cr release test, the rosette test, and the chemiluminescence test (CLT). In the ⁵¹Cr release test, the patient is injected with ⁵¹Cr-labeled donor RBCs, and the half-life of the labeled RBCs is monitored and is predictive of post-transfusion survival or clearance^12,13. As this method uses radioactive materials, it is rarely performed anymore. The rosette test involves mixing and incubating monocytes with RBCs and quantifying the level of rosette formation (with no phagocytosis)¹⁴. The clinical significance of antibodies in vivo involves active phagocytosis by macrophages found in the spleen and/or the liver; thus, this method does not provide a relevant readout of phagocytosis. The CLT uses luminol to monitor the oxidative burst during monocyte phagocytosis of RBC, since luminol fluoresces blue when oxidized in the phagosome¹⁵. This method is good, but contamination by neutrophils can confound the readout. Parallel comparisons have been made to evaluate the sensitivity, practicality, and reproducibility of the four available methods, and both the CLT and MMA were ranked superior¹⁶. However, the CLT has been mainly utilized in assessing hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN), and the assay’s optimal pH of 8.0 might compromise the level of phagocytosis¹¹.

In addition to its diagnostic and clinical utility, the MMA has been modified for other research purposes. Indeed, the MMA can not only serve as a functional assay to address discrepancies between serology and biology, it has also been used to retrospectively investigate the cause of hemolysis after intravenous immunoglobulin (IVIG) therapy¹⁷. It has also been used to examine the structure-function of chemical inhibitors of FcγR-mediated phagocytosis^18-20 and to study the downstream signaling of FcγR-mediated phagocytosis²¹. In our laboratory, in addition to using a human MMA, we are developing a murine MMA using primary mouse peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and autologous RBCs. The rationale is to screen antibodies that can induce FcγR-mediated phagocytosis as an intermediate to developing an in vivo autoimmune hemolytic anemia (AIHA) mouse model (unpublished data). The various modifications focus on different aspects of the IgG antibody and FcγR interaction that induce phagocytosis.

Protocol

Få godkjenning for bruk av humane prøver av forskningsetiske brett / Institutional Review Board, og få signert samtykke fra alle menneskelige givere. MMA kan også utføres ved hjelp av muse PBMC på en lignende måte som den menneskelige analysen, etter bruk dyr etikk godkjenning. MMA benytter aseptiske vevskulturteknikker. MERK: Se figur 1. MERK: Selv om vi anbefaler bruk av en nivå 2 biocontainment skap under analysen for å opprettholde aseptisk teknikk, som metoden er bare et "kortsiktig" kultur-metoden, det er egentlig ikke nok tid for bakterier å forurense analysen. Derfor, hvis en nivå 2 biocontainment skapet ikke finnes, i stedet for å kjøpe en bare for denne analysen, assayet kan utføres utenfor en biocontainment kabinett, på en åpen benk. Bruken av en 37 ° C inkubator med 5% CO2, men er ikke et alternativ, og må brukes foroptimale resultater. 1. perifere mononukleære blod Cell Isolation Skaff humant fullblod fra en frisk donor eller en pasient via venepunksjon ved hjelp vacutainers inneholder syre-citrat-dekstrose (ACD) antikoagulerende (gul-topp rør). MERK: Fullblod kan lagres i ACD ved romtemperatur (18-22 ° C) i opptil 36 timer før du går videre til neste trinn 11. Normalt 1-2 10-ml vakuumrør av helblod er tilstrekkelig for analysen. Fortynn den fullblod 1: 1 volum / volum i varm komplett RPMI-medium (RPMI-1640 supplert med 10% føtalt bovint serum, 20 mM HEPES, og 0,01 mg / ml gentamicin). Isoler perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra fortynnet fullblod ved hjelp densitetsgradientsentrifugering, som anbefalt av produsenten (se liste over Materials). Lag det fortynnede blodet meget langsomt i løpet av densitetsgradienten (oppvarmet til romtemperatur, 18-22 ° C). MERK: Minimer mengden av Mixing ved grenseflaten for optimal separasjon av blod ved forsiktig lagdeling blodet blandingen i en dråpevis måte eller ved hjelp av en pipette. Tillat blodet blandingen langsomt lag over toppen av densitetsgradienten ved å plassere pipettespissen nær densitetsgradienten og ved at blodet blandingen kan renne ned langs siden av røret meget langsomt. Alt etter omfanget av forsøket, laget 10 ml blod blanding på toppen av 3 ml densitet-gradient (i en 15-ml tube) eller lag 35 ml blod blanding på toppen av 15 ml densitet-gradient (i en 50-mL rør). Typisk 10 ml fullblod gir 10 millioner PBMC, med noen donor til donor variasjon. Merk: Det er meget viktig at det ikke forekommer noen blanding av blodet blanding med densitetsgradienten. Blodblandingen bør lag over den densitetsgradient og langsomt stiger inntil alt blodet er på toppen av densitetsgradienten. Sentrifuger den lagdelte blandingen ved 700 xg i 30 minutter uten bremser. den centrifuged blandingen bør skilles i 5 lag (fra topp til bunn): plasma, buffy coat (som inneholder PBMC), tettshetsgradient materielle, granulocytter, og RBC. Fjern og kast det meste av plasma og nøye hente buffy coat (PBMC) innhold i en ny 15-ml tube ved hjelp av en Pasteur pipette og en sugekilden. MERK: Fjerning av buffy coat-laget er effektivt gjøres ved å anvende suging på den Pasteur pipette mens de utfører en sirkulær bevegelse rundt utsiden av laget, med spissen av pipetten mot røret. Vask de isolerte PBMC tre ganger i pH 7,3 fosfat-bufret saltvann (PBS) ved sentrifugering ved 350 xg i 10 min (med full brems) i mellom hver vask. Rekonstituere PBMC pellet i fullstendig RPMI medium. Avhengig av størrelsen av pelleten, 3-7 ml av mediet er tilstrekkelig. Tell PBMC ved hjelp av trypanblått og et hemocytometer. Bare telle disse cellene som ikke er farget av trypanblått. Reconstitute de PBMC til 1.750.000 celler / ml i fullstendig RPMI medium. Frø 400 ul (700.000 celler) i hver brønn av en 8-kammer lysbilde. Inkuber objektglasset i en 37 ° C, fullt ut fuktet vevskulturinkubator (supplert med 5% CO2) i 1 time for å tillate at monocytter / makrofager til å følge. 2. Forbehandling av levd Monocytter MERK: Dette trinnet er bare nødvendig hvis du leter etter måter å hemme eller forsterke fagocytose. Pre-treat levd monocytter med noe narkotika (e) eller forbindelsen (e) av interesse. Rekondisjonering av medikamentet (e) eller annet testmaterialet til den ønskede konsentrasjon ved hjelp av fullstendig RPMI-medium. NB: For eksempel er 200 ug / ml av IVIG vanligvis brukes for å gi en 95-100% inhibering av fagocytose ved bruk av humane monocytter. Aspirer og kast supernatant inneholdende ethvert ikke-heftende celler fra den 8-kammeret lysbilde etter en-timers inkubasjon (etter trinn 1.6). Bytt den ut med 400ul av et medikament eller en annen behandling og inkuberes i 1 time ved 37 ° C. Når aspirere og erstatte løsninger i 8-kammer lysbilde, sørg for å styre strømmen av væsker, slik at svakt levd cellene ikke løft av. Dessuten arbeider med bare 2-3 tomme brønner i en tid og unngå tørking av brønnene. MERK: Vanligvis er hver behandling utføres i tekniske triplicates. 3. opsonisering av R 2 R 2 røde blodlegemer MERK: R2 R2 er brukt her er hentet fra Blodprøvetaking Senter (Canadian Blood Services), men de er også kommersielt tilgjengelig. Opsonisert R2 R2-RBC-er brukt som en positiv kontroll for FcγR-mediert fagocytose. Naive R2 R2 bør lagres i Alsever løsning (for å forlenge holdbarheten) ved 4 ° C i opptil en måned. Alsever løsning er gjort i huset og består av 0,8% Vekt / volum trinatriumcitrat (dihydrat), 1,9% w / v glukose, 0,42% vekt / volum natriumklorid, og 0,05% vekt / volum sitronsyre (monohydrat). Hvis R 2 R 2 celler ikke er tilgjengelige, andre Rh-fenotypiseres celler, slik som R 1 R 2 R 1 R 1, R 1 R, eller R 2 R, kan anvendes. Vask R2 R2 (CDE / CDE) røde blodlegemer i PBS totalt tre ganger med sentrifugering ved 350 xg i 5 min hver. MERK: Mengden av RBC som trengs avhenger av den eksperimentelle størrelse og kan være back-beregnet. Vask alltid et overskudd av RBC-er, ettersom RBC-er går tapt ved hver vask på grunn av lysis eller under fjerning av supernatanten. For eksempel, i et forsøk med 5 behandlinger og 2 kontroller, alle utført i tekniske triplicates, det er totalt 21 brønner. 21 brønner med 400 pl / brønn av 1,25% RBC blanding indikerer at 105 ul av pakket, opsonisert RBC er nødvendig. 200 ul av RBC bør innledningsvis vaskes og 150 & #181; L bør opsonisert for å sikre at det er en tilstrekkelig mengde av RBC for fagocytose trinnet. Opsonisere den vaskede R2 R2 pellet med 1: 1 volum / volum av polyklonale anti-D-antistoffer fra humant serum og inkuberes i 1 time ved 37 ° C med leilighetsvis blanding. MERK: Hvis polyklonale anti-D-antistoffer ikke er tilgjengelig, er det mulig å bruke monoklonale anti-D-antistoffer, som er kommersielt tilgjengelige, eller anti-D som normalt brukes for Rh immune profylakse, som kan fås fra blodbanker eller transfusjon tjenester. Optimalisering testing bør gjennomføres i begynnelsen, når du setter opp analysen, og når du bytter masse un-titered polyklonale antistoffer eller bytte til et monoklonalt antistoff. Dette er for å identifisere den optimale konsentrasjonen eller volumet av anti-D som er nødvendig for en antiglobulin test (IAT) produktet av mellom 3+ og 4+ og et fagocytose resultat på mellom 70-90 fagocytterte RBC per 100 monocytter telles. Vask opsonisered R 2 R 2 til sammen tre ganger i PBS ved hjelp av sentrifugering ved 350 xg i 5 min hver. MERK: Vellykket opsonization av R2 R2 kan bekreftes ved å utføre en indirekte IAT. I korthet, blir sekundære polyklonale anti-humane antistoffer tilsatt for å binde primære opsonizing antistoffer på RBC flater, og det forsterkede signal kan observeres i form av hemagglutinering. En detaljert produsent protokollen kan bli funnet i supplerende materiale fil. Rekonstituere vasket R2 R2 pellet til 1,25% v / v hjelp komplett RPMI medium. MERK: Overskudd av opsonisert R 2 R2 kan lagres i Alsever løsning ved 4 ° C i opp til en uke. 4. Fc-reseptor-mediert Fagocytose Aspirer medikament eller et medium supernatant fra 8-kammeret lysbilde og tilsett 400 ul av 1,25% volum / volum R2 R2 blanding. Inkuber ved 37 ° C i 2 timer. After to h inkubasjon fjerne kamrene ved hjelp av produsentens adaptere. DAB av overflødig R2 R2 på et papirhåndkle. Pass på at raset ikke tørker ut. Fyll en 100-ml beger med PBS. Senk og vaske raset ved sakte å bevege glide frem og tilbake (rundt 30-40 slag) for å fjerne det meste av un-phagocytosed R2 R2. Fjern lysbildet fra PBS. DAB av overflødig PBS ved hjelp av et papirhåndkle eller vev og luft-tørke lysbildet. Fest lufttørket lysbilde i 100% metanol i 45 s. Deretter luft-tørke fast lysbilde. MERK: Lysbilder kan løses ved hjelp en annen metode som er mer kompatibel for nedstrøms flekker, som for eksempel Grünwald-Giemsa beis 21 eller Wright-Giemsa beis 22. Monter lysbildet bruker en in-house-laget elvanol montering medium (eller en annen kommersielt tilgjengelig monteringsmedium) og legge dekkglass. MERK: Elvanol montering medium er sammensatt av 15% w / v polyvinyl alkohol-harpiks og 30% volum / volum glycerol i PBS. Blandingen oppvarmes inntil all harpiksen er oppløst, og glyserinet er homogent blandet. Dette kan erstattes med andre kommersielt tilgjengelige monteringsmedium. La mount tørke over natten før kvantifisering. 5. Kvantifisering av Fagocytose Ved hjelp av et fasekontrastmikroskop og et 40X objektiv, manuelt kvantifisere mengden av fagocyterende hendelser ved å telle minst 200 monocytter og antall phagocytosed R2 R2 innenfor disse monocytter. Ha en teller i hver hånd for samtidig å kvantifisere antallet av monocytter og antallet phagocytosed R2 R2. Skaff gjennomsnittlig phagocytic indeksen ved å dividere antall phagocytosed R2 R2 med antall monocytter og multiplisere med 100. Express data gjennomsnittet (gjennomsnittlig phagocytic indeks) ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM). </li>

Representative Results

Ved å følge de viktigste trinnene i figur 1 og fremgangsmåten skissert ovenfor, kan det være MMA reproduserbart utført. IVIG ble anvendt som et eksempel for inhibering av fagocytose i figur 2. IVIG er kjent for å binde seg og blokkere Fc-reseptorer, og således inhibere den nedstrøms utfallet av fagocytose. Ved å titrere mengden av IVIG anvendes, er en dose-avhengig hemming observert, i hvilke konsentrasjoner over 200 pg / ml resulterte i nær 100% inhibering og konsentrasjoner under 0,5 mikrogram / ml hemmet ikke i det hele tatt (figur 2A). Når fagocytiske indekser blir transformert og normalisert til R2 R2 positiv kontroll som 0% inhibering, en inhiberingskurve med en IC50 på 3 mikrogram / ml kan bli bestemt (figur 2B). I tillegg til å utføre analysen konsekvent, quantificasjon av analysen kan noen ganger være vanskelig. Figur 3 er en samling av fasekontrastmikroskopi bilder av ulike MMA lysbilder. Med mikroskopi erfaring, kan man skille mellom en monocytt fra en forurensende RBC (figur 3D), eller en vakuole fra en phagocytosed RBC (figur 3B). Tette klynger av celler og / eller rusk bør unngås under kvantifisering (Tall 3E og F). I tillegg bør man unngå over opsonizing R 2 R 2 RBC, noe som ville føre til økt fagocytose at overcrowds monocytt interiør og forstyrrer nøyaktig kvantifisering (Figur 3C). Figur 1. Skjematisk fremstilling av MMA. En trinn-for-trinn skildring av de viktigste trinnene i MMA: isolere PBMC fra fullblod, fôring levd monocytes med opsonisert R2 R2, og vaske kammer lysbilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2. Intravenøs IgG (IVIG) inhiberer in vitro fagocytose ved hjelp av MMA. IVIG er kjent for å hemme fagocytose og brukes som en hemning kontroll i den menneskelige MMA. (A) Titrering av IVIG resulterte i en doseavhengig inhibering av fagocytose når sammenlignet med den ubehandlede R2 R2 kontroll. Resultatene viser gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM) av n = 3 forsøk. Den statistiske analysen ble utført ved bruk av Student t-test: ** P≤0.01 og *** P≤0.001. (B) Inhibering kurve av IVIG med en IC50 of 3 ug / ml (prikket linje). Resultatene viser dataene normalisert til ubehandlet R2 R2 (0% inhibering); middelverdi ± SEM av n = 3 forsøk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 3. fase kontrast mikroskopi bilder av prøveglass i henhold til 40X forstørrelse. (A) Den perfekte lysbilde der monocytter phagocytosed 1-2 R2 R2 i gjennomsnitt (svarte piler med en særegen glorie glød), med svært få forurensende, un-phagocytosed R2 R2 i bakgrunnen (hvite piler). (B) Som vist i dette lysbildet, monocytter noen ganger har forstørret vakuoler (hvite piler), som kan forveksles med phagocytosed R2 R2. (C </ strong>) Når R2 R2 har vært over-opsonisert, mer enn 4-5 phagocytosed R2 R2 per monocytter (svarte piler) gjengi nøyaktig telling vanskelig, siden R2 R2 er overfylt i monocytter og distinkte celle grenser ikke kan skilles. (D) Utilstrekkelig vasking av raset fører til rikelig R2 R2 forurensning (hvite piler), som kan forveksles følges RBC. (E) og til, monocytter og forurensende røde blodlegemer kan danne klaser. Klynger også indikere bakteriell forurensning, noe som bør unngås. (F) Monocytter kan danne større aggregater, noe som bør unngås under kvantifisering. Ved hjelp av tilfeldig utvalg av feltene for å se, er panel A hva er vanligvis observert om MMA er korrekt utført. Scale bar er 20 mikrometer. Klikk herfor å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

MMA er en arbeidskrevende teknikk som krever kompetanse i både vev kultur og mikroskopi. Det er flere viktige tiltak for å sikre suksess: 1) generasjon av monocytt monolayer; 2) opsonization av RBC, og 3) manuell kvantifisering. Den monocytt-monolaget ikke fester seg meget sterkt til kammeret lysbilde, så fysiologisk pH må opprettholdes gjennom hele analysen ¹¹ og et tilstrekkelig antall av PBMC skal podes. Under kraftig pipettering, som kan forstyrre det adherte celler, bør unngås. En tilnærming er å alltid fjerne og legge løsninger fra det samme hjørnet av kammeret og for å sikre at bevegelsen er langsom og jevn. Likeledes, i løpet av det siste vasketrinn for å fjerne overskudd av RBC, bør bevegelsen være langsom og jevn. Dette sikrer minimal forstyrrelse av monolaget og samtidig å fjerne mesteparten av de un-phagocytosed RBCs. Utilstrekkelig vasking vil føre til en høy bakgrunn av forurensende røde blodlegemer, noe som gjør manuell quantification vanskelig. Dernest må de _a R R ₂ RBC være tilstrekkelig opsonisert for å oppnå et gjennomsnitt fagocytisk indeks på 80-120 for fagocytose kontroll. Denne ønskede fagocytisk rekkevidde basert på en balanse mellom den enkle telle (f.eks monocytter med mer enn 5 phagocytosed RBCs er vanskelig å nøyaktig kvantifisere) og opprettholde en tilstrekkelig mengde av fagocytose for statistisk analyse. Graden av opsonization kan bekreftes ved en IAT, og en lese mellom 3+ til 4+ er nødvendig. R ₂ R ₂ RBC-er skal kastes når det er overflødig lyse under vask, når supernatanten blir mørk rød, eller når en betydelig reduksjon i fagocytose er observert i eksperimenter på grunn av aldring av cellene i lagring. Til slutt kan manuell kvantifisering ved hjelp av mikroskop være vanskelig, spesielt når man sammenligner teller mellom lab personell og mellom eksperimenter. Ved å undersøke den samme felt på hver brønn, eller ganske enkelt ved å telle flere cellerKan oppnås en mer konsistent teller. Side-ved-side trening med en erfaren tekniker og bruk av et utpekt sett med trenings slides anbefales.

En viktig kritikk av MMA er subjektivitet av håndboken kvantifisering trinn. Men med tilstrekkelig trening, konsistens kan oppnås på tvers av forskjellige tellere. En annen begrensning er den iboende donor-til-donor forskjeller i monocytt fagocytiske egenskaper og i _{R-2 R-2-overflateantigenet} ekspresjonsnivåer, som er en kilde til variasjon av data når håndtere humane prøver.

Andre alternative teknikker er tilgjengelige for å undersøke FcγR-mediert fagocytose. Flertallet av kommersielle sett utnytte fluoriserende effekt for å overvåke fagocytose (f.eks bioparticles, pH-sensitive fluorescens-protein, eller IgG-merkede fluorescerende latekskuler). Bruk av fluoriserende effekt ikke tilbyr mer objektiv kvantifisering, men man trenger også å lureSider tilgjengelighet, kostnad, og trening i forbindelse med bruk av en fluorescerende mikroskop eller et flowcytometer, så vel som den påfølgende avhengighet av kommersielt tilgjengelige sett.

Endelig kan denne analysen modifiseres avhengig av problemstillingen. For eksempel, ved testing av medikament hemming av fagocytose, monocytter kan enten være forhåndsbehandlet eller ko-inkubert med både legemidler og opsonisert RBC-er (det vil si en konkurranseanalyse). Den nedstrøms signalisering av antistoffer med forskjellige undertyper, kimære antistoffer eller rekombinante konstruksjoner kan også bli testet. Med de siste gjennombrudd i utviklingen av en universell antigen-null blod ^24, kan den MMA utnyttes i første skjermer av disse antigen-RBCs null med forskjellige antistoffer for å vurdere hvorvidt det er faktisk en lavere effekt i utløser fagocytose.

Materials

Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers	BD	REF364606
RPMI 1640	Sigma	R8758
HEPES	Bioshop	HEP003.100
Fetal bovine serum	Multicell	080150
Gentamicin	Gibco	15710-64
Ficoll-Paque PLUS	GE	17-1440-03	https://www.gelifesciences.com/
Phosphate buffered saline	Sigma	D8537
8-chamber slides	Lab-Tek-ll	154534
R2R2 (cDE/cDE) red blood cells	Canadian Blood Services		Commercially available (e.g. http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)
Polyclonal anti-D from human serum	Gamma Biologics	DIN 02247724	Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin
100% methanol	Caledon	6700-1-42
Polyvinyl alcohol resin	Sigma	P8136	Can be substituted with commercially available mount
UltraPure glycerine	Invitrogen	15514-011
Cover slips	VWR	48366 067
Novaclone anti-IgG	Immucorgamma	5461023	Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/…/ucm081743.pdf)