In Situ Erkennung und Quantifizierung der einzelnen Zelle von Metall-Oxid-Nanopartikel mit nuklearen Mikrosonde Analyse
Summary
Wir beschreiben Sie ein Verfahren zur Detektion von chemischen Elementen vorhanden in Situ in menschlichen Zellen sowie deren Quantifizierung in Vitro . Die Methode eignet sich gut für jeden Zelltyp und eignet sich besonders zur quantitativen chemischen Analyse in einzelnen Zellen nach in-vitro- Metall-Oxid-Nanopartikel-Exposition.
Abstract
Mikro-analytischen Techniken, basierend auf chemischen Elements Bildgebung ermöglichen die Lokalisierung und Quantifizierung der chemischen Zusammensetzung auf zellulärer Ebene. Sie bieten neue Möglichkeiten zur Charakterisierung von lebenden Systemen und eignen sich besonders für die Erkennung, Lokalisierung und das Vorhandensein von Metall-Nanopartikeln in biologischen Proben und die Umwelt zu quantifizieren. In der Tat erfüllen diese Techniken alle relevante Anforderungen im Hinblick auf (i) Empfindlichkeit (von 1 bis 10 µg.g-1 Trockenmasse), (Ii) Mikrometer Bereich Ortsauflösung und (Iii) Multi-Element-Erkennung. Angesichts dieser Merkmale, Microbeam Chemisches Element Bildgebung kann kraftvoll ergänzen routinemäßige bildgebende Verfahren wie z. B. optische und Fluoreszenz-Mikroskopie. Dieses Protokoll beschreibt, wie eine nukleare Mikrosonde Analysen auf kultivierten Zellen (U2OS), Titandioxid-Nanopartikeln ausgesetzt. Zellen müssen wachsen auf und direkt in eine speziell entwickelte Probenhalter auf das optische Mikroskop verwendet und in der nuklearen Mikrosonde Analyse ausgesetzt werden. Sprung-Freeze kryogenen Fixierung der Proben bewahrt die zelluläre Organisation und den chemischen Elementeverteilung. Gleichzeitige nuklearen Mikrosonde (Scan Transmissions-Ion-Mikroskopie, Rutherford backscattering Spectrometry und Partikel induzierte Röntgenemission) durchgeführte Analyse auf die Probe enthält Informationen über die zelluläre Dichte, die räumliche Verteilung von die chemischen Elemente, als auch die zelluläre Inhalt von Nanopartikeln. Es gibt ein wachsender Bedarf für solche analytischen Werkzeuge innerhalb der Biologie, insbesondere der aufstrebenden Nanotoxikologie und Nanomedizin, wofür unser Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Nanopartikeln und biologischen Proben vertieft werden muss. Insbesondere, wie nukleare Mikrosonde Analysen keine Nanopartikel gekennzeichnet zu werden erfordert, sind Nanopartikel Häufigkeiten quantifizierbare bis auf die einzelne Zellenebene in einer Zellpopulation, unabhängig von ihrer Oberflächenzustand.
Introduction
Zelluläre Homöostase richtet sich nach der Aufnahme kontrollieren, Assimilation und intrazelluläre Lokalisation der verschiedenen Spurenelementen (Ionen, Metalle, exogene anorganischen Verbindungen). Diese Komponenten sind häufig in Form von Spuren, aber dennoch möglicherweise erhebliche Auswirkungen in der System-Physiologie. Somit ist die Studie der Zellbiochemie in normalen und pathologischen/betonte Situationen ein Schlüssel-Schritt, ein allgemeines Verständnis der zellulären metabolischen Mechanismen. Daher wird die Entwicklung der Bildgebung und analytische Techniken ermöglichen die Untersuchung der intrazellulären chemischen Häufigkeiten, Aufbauorganisation und ihre damit verbundenen Stoffwechselfunktionen erforderlich. Sehr wenige Methoden sind in der Lage, eine in Situ quantitative Stück von Informationen über die insgesamt chemische Natur von einer Probe. Neben Methoden analysieren Proben in loser Form, in Situ Analysen betrachten biologische Proben in ihrer Vollständigkeit ohne Masse und strukturellen Informationen und bewahrt somit ihre konstituierenden Chemikalien (Spurenelemente und Ionen) und Proteine. Darüber hinaus wie die Nanowissenschaften ständig weiterentwickeln, werden verbesserte Bildgebung und analytischen Methoden zur Überwachung der Umwelt auf der zellulären Ebene notwendig sein, zu beobachten und zu quantifizieren, Nano-Objekt Verhalten und Interaktionen. 1
Nanopartikeln (NPs) wurden als Objekte ausstellen mindestens eine Gesichts Dimension im Bereich 1 und 100 nm definiert. 2 aufgrund ihrer besonderen physikalisch-chemischen Eigenschaften NPs ausgiebig in der Industrie verwendet werden. NPs sind in Bio-Anwendungen und Nanomedizin beschäftigt. 3 , 4 trotz der zahlreichen physikalisch-chemischen Eigenschaften von NPs, können sie einige Risiken von Nebenwirkungen auf die menschliche Gesundheit und Umwelt erzeugen. Diese Risiken können durch längere und wiederholte Exposition mit verschiedenen Konzentrationen induziert werden, und dies ist noch nicht eindeutig geklärt. 5 , 6 , 7 , 8 vor allem das Schicksal des NPs im Inneren der Zellen und der damit verbundenen zellulären Antworten sind bis heute nicht vollständig beschrieben. Dies ist zum Teil aufgrund der Knappheit der Methoden, mit denen die Erkennung und Quantifizierung von verinnerlichten NPs in einer einzelnen Zelle. 9
Die klassischen analytischen Werkzeuge zur Schätzung die zelluläre Dosis von Nanopartikeln sind Microscopies, Massenspektrometrie (MS), gekoppelt induktiv Plasma MS (ICP-MS)10,11 und Flüssigchromatographie bieten MS (LC-MS), sondern sie nur nützliche Informationen auf der makroskopischen Skala. Keiner von ihnen kann eine genaue Auswertung der subzellulären NPs-Inhalt noch die NPs-Verteilung ohne den Einsatz der Fraktionierung Methoden bereitstellen. Eine systematische Bewertung der Dosis-Wirkungs-ist somit unmöglich mit diesen Methoden, im Gegensatz zu Methoden der Atomspektroskopie wie nukleare Mikrosonde Analyse12,13, Synchrotron-Röntgen-Fluoreszenz-Mikroskopie14 , und sekundären Ionen-Massenspektrometrie (SIMS). 15 , 16 diese Methoden sind besonders interessant, da sie Beobachtungen mit Fluoreszenz-Mikroskopie ergänzen, insbesondere wenn NPs können nicht mit fluoreszierenden Molekülen gekennzeichnet werden und sind somit in ihrem nativen Zustand untersucht. Zu einem gewissen Grad auch bei NPs mit Fluorophore, gepfropft sind bleibt (i) Quantifizierung schwierig weil das tagging Niveau pro NP unbekannt ist und (Ii) die chemische Modifizierung der Oberfläche NP kann die zelluläre Verteilung ändern.
In diesem Artikel wir konzentrieren uns auf eine Methode basiert auf einer Kombination von nuklearen Mikrosonde Techniken mit dem Ziel die Morphologie und die elementare Zusammensetzung von biologischen Proben in Dur, Moll, imaging und Konzentrationen zu verfolgen.
Nukleare Mikrosonde Analyse erweist sich als besonders geeignet für die Messung von chemischen Spurenelementen in biologischen Geweben. Der Strahl laterale Auflösung (0,3 bis 1 µm) und die Empfindlichkeit in Chemisches Element Erkennung (von 1 bis 10 µg.g-1 Trockenmasse) eignen sich gut für Studien auf zellulärer Ebene. Nukleare Mikrosonde Techniken basieren auf Partikel Detektion (Photonen, Elektronen, Ionen) ausgegeben, nachdem der Ionenstrahl (in der Regel läuft bei MeV Energien) Atome in der Probe vorhanden interagiert. Interaktionen, die in Zellen sind vor allem: 1) Anregung/Ionisation von Atomen, gefolgt von einer Emission von Photonen nach Rückkehr Atome in ihren grundlegenden Zustand; und 2) Diffusion von eingehenden Teilchen führt, um in ihrer Energie und Richtung zu ändern. Die Messung der emittierten Teilchen Energie Allowsthe Identifikation von Atomen an der Interaktion beteiligten. Um die Zuordnung der Elemente ausführen, wird die Ionen-Microbeam wiederholt über die Probenoberfläche oft auf einer Fläche von ca. 100 x 100 µm2 mit mehreren Zellen gescannt. Emittierten Partikel werden erkannt und ihre Energie für jede Strahllage aufgezeichnet. Sortierung der Partikel nach der Strahllage, ist identifiziert die Struktur verantwortlich für die Emission solcher Partikel das Ziel der Datenverarbeitung. Hier beschreiben wir präzise Umsetzung beruht auf Fluoreszenz-Mikroskopie und nukleare Mikrosonde Analysen zu erkennen sowie exogene NPs bei der zellulären und subzellulären Maßstäben zu quantifizieren, um die Folgen der NP Interaktionen mit lebendigen untersuchen Systeme. Wir sind besonders auf die Möglichkeiten dieser Methode in Bezug auf in Situ Quantifizierung von Titandioxid-Nanopartikeln (TiO2 NPs) Aggregaten auf der subzellulären Ebene konzentrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben eine Methode, die nützliche Informationen über das hinaus, was mit anderen bildgebenden Verfahren, vor allem auf der subzellulären Ebene möglich. Nukleare Mikrosonde Analysen bietet neben seiner bildgebenden Fähigkeit Möglichkeiten der Quantifizierung der chemischen Elemente in der Zusammensetzung von einer biologischen Probe eingeben. In der vorliegenden Arbeit wir studierte menschliche Zell-Populationen und konzentrierte sich auf die Analyse von einer gewählten Region of Interest basierend auf ei…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Serge Borderes für Regie und Schnitt des Videos. Die französische National Research Agency unterstützt das Forschungsprogramm TITANIUMS (ANR CES 2010 n ° CESA 009-01). CNRS und der Europäischen Gemeinschaft als Integration Tätigkeit zur Verfügung gestellt die “Unterstützung von öffentlichen und industriellen Forschung verwenden Ion Beam Technologie (Geist)” unter den EG-Vertrag Nr. 227012. Diese Arbeit wurde von Marie-Curie-Maßnahmen – Initial Training Networks (ITN) als eine “Integration Aktivität unterstützen Postgraduate Research mit Praktika in Industrie und Ausbildung Excellence” (SPRITE, D1.3) EG-Vertrag Nr. 317169 unterstützt. C’NANO Grand Sud Ouest und die Region Aquitaine unterstützen das Forschungsprogramm TOX-NANO (n ° 20111201003) und das Forschungsprogramm POPRA (n ° 14006636-034).
Materials
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
Riferimenti
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