In Situ Deteção e única célula quantificação de nanopartículas de óxido de Metal usando análise de microsonda Nuclear
Summary
Descrevemos um procedimento para a detecção de elementos químicos presentes em situ em células humanas, bem como a sua quantificação em vitro . O método é adequado para qualquer tipo de célula e é particularmente útil para análises químicas quantitativas em células únicas em vitro exposição a nanopartículas de óxido metálico.
Abstract
Técnicas de microanálise com base nas imagens do elemento químico permitem a localização e quantificação de composição química a nível celular. Eles oferecem novas possibilidades para a caracterização dos sistemas vivos e são particularmente adequados para detectar, localizar e quantificar a presença de nanopartículas de óxido de metal, tanto em amostras biológicas e do ambiente. Na verdade, todas essas técnicas requisitos relevantes em termos de sensibilidade (i) (de 1 até 10-µg.g-1 de massa seca), micrômetro (ii) escala de resolução espacial e a detecção de vários elemento de (iii). Tendo em conta estas características, imagens de elemento químico microbeam podem poderosamente complementar técnicas de imagem de rotina tais como óptica e microscopia de fluorescência. Este protocolo descreve como realizar uma análise microsonda nuclear em células cultivadas (U2OS) expostas a nanopartículas de dióxido de titânio. As células devem crescer e ser expostas diretamente em um suporte de amostra especialmente projetado usado no microscópio óptico e na fase de análise microsonda nuclear. Mergulho-congelamento criogênica fixação das amostras preserva a organização celular e a distribuição do elemento químico. Análise de simultânea microsonda nuclear (microscopia de transmissão íon, espectrometria de Retrodispersão de Rutherford e partícula induzida por emissão de raios x) realizada na amostra fornece informações sobre a densidade celular, a distribuição local de os elementos químicos, bem como o conteúdo celular de nanopartículas. Há uma necessidade crescente de tais ferramentas analíticas dentro biologia, especialmente no contexto emergente de Nanotoxicology e nanomedicina para o qual deve ser aprofundado nossa compreensão das interacções entre as nanopartículas e amostras biológicas. Em particular, como análise de microsonda nuclear não requer nanopartículas de ser rotulados, abundâncias de nanopartículas são quantificáveis para o nível de células individuais em uma população celular, independentemente do seu estado de superfície.
Introduction
Homeostase celular é determinado pelo controle de absorção, assimilação e localização intracelular de diferentes elementos de traço (íons, metais, compostos inorgânicos exógenos). Estes componentes são frequentemente sob a forma de vestígios, mas, no entanto, podem ter um impacto considerável na fisiologia do sistema. Assim, o estudo da bioquímica celular em situações normais e patológicos/estressado é um passo-chave para uma compreensão geral dos mecanismos metabólicos celulares. Portanto, o desenvolvimento de técnicas analíticas e de imagem, permitindo a investigação de abundâncias químicas intracelulares, organização estrutural e suas funções metabólicas relacionadas torna-se necessário. Muito poucos métodos são capazes de fornecer uma em situ parte quantitativa de informações relativas à natureza química geral de uma determinada amostra. Além de métodos de análise de amostras a granel, em situ análises consideram amostras biológicas em sua integralidade, sem perda de informações em massa e estruturais, preservando seus constituintes químicos (oligo-elementos e íons) e proteínas. Além disso, como as nanociências continuam a desenvolver, imagem melhorada e métodos analíticos para monitoramento ambiental à escala celular será necessários observar e quantificar as interações e comportamentos de nano-objeto. 1
Nanopartículas (NPs) foram definidas como objetos exibindo ao menos uma dimensão facial na faixa 1 e 100 nm. 2 devido a suas propriedades físico-químicas particulares, NPs são amplamente utilizado na indústria. O NPs é empregado em aplicações de bio e em nanomedicina. 3 , 4 apesar de numerosas características físico-químicas do NPs, eles podem gerar alguns riscos de efeitos adversos na saúde humana e o ambiente. Estes riscos podem ser induzidos por exposição prolongada e repetitiva em vários níveis de concentração e isto ainda não foi claramente estabelecido. 5 , 6 , 7 , 8 em particular, o destino do NPs dentro de células e a resposta celular associada são, até à data, não totalmente descrito. Isto é em parte devido à escassez de métodos que permitir a detecção e quantificação de NPs interiorizado em uma única célula. 9
As ferramentas analíticas clássicas usadas para estimar a dose celular de nanopartículas são microscopies, espectrometria de massa (MS), acoplado indutivamente plasma MS (ICP-MS)10,11 e cromatografia líquida de que MS (LC-MS), mas eles só fornecem informações úteis à escala macroscópica. Nenhum deles pode fornecer uma avaliação exacta do NPs subcellular conteúdo nem a distribuição de NPs, sem o uso de métodos de fracionamento. Uma avaliação sistemática da dose-resposta, portanto, é impossível com esses métodos, ao contrário de métodos baseados em espectroscopia atômica como nuclear microsonda análise12,13, microscopia de fluorescência de raios-x de síncrotron14 e espectrometria de massa de iões secundários (SIMS). 15 , 16 estes métodos são particularmente interessantes como se complementam as observações feitas usando microscopia de fluorescência, especialmente quando o NPs não podem ser rotulado com moléculas fluorescentes e, portanto, é estudado em seu estado nativo. Em certa medida, mesmo quando NPs é enxertado com fluorophores, (i) a quantificação continua a ser difícil porque o nível de marcação por NP é desconhecido e (ii) a modificação química da superfície NP pode modificar sua distribuição celular.
Neste artigo, nós centrar-se em um método com base em uma combinação de técnicas nucleares microsonda visando a morfologia e a composição elementar da espécimes biológicos em maior, menor, de imagem e rastrear as concentrações.
Microsonda nuclear análise revela-se particularmente adequado para a medição de oligo-elementos químicos em tecidos biológicos. A resolução lateral de feixe (0,3 a 1 µm) e a sensibilidade na deteção de elemento químico (de 1 a 10 µg.g-1 massa seco) são adequados para estudos a nível celular. Microsonda nuclear técnicas baseiam-se na deteção de partículas (fótons, elétrons, íons) emitida depois que o feixe de iões (normalmente rodando a energias de MeV) interage com átomos presentes na amostra. Interações que ocorrem nas células são principalmente: 1) excitação/ionização de átomos, seguido de uma emissão de fótons depois de átomos retornam ao seu estado fundamental; e 2) difusão de partículas entradas levando a mudança em sua energia e direção. A medição de identificação de allowsthe de energia de partículas emitido dos átomos envolvidos na interação. Para executar o mapeamento de elementos, o íon microbeam é repetidamente verificada sobre a superfície da amostra, muitas vezes por uma área de cerca de 100 por 100 µm2 contendo várias células. São detectadas partículas emitidas e sua energia é registrada para cada posição do feixe. Classificação de partículas de acordo com a posição do feixe, assim, identificar a estrutura responsável pela emissão de partículas é o objetivo do tratamento de dados. Aqui, descrevemos precisamente uma abordagem baseada na análise de microsonda nuclear para detectar bem como quantificar exógeno NPs nos celulares e celulares sub escalas, a fim de investigar as consequências das interações NP com vivos e microscopia de fluorescência sistemas. Nós particularmente concentrará sobre as oportunidades oferecidas por esse método em termos de quantificação em situ de dióxido de titânio (TiO2 NPs) de nanopartículas agregados no nível subcellular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos um método de fornecer informações úteis, além do que é possível com outras técnicas de imagem, especialmente a nível subcelular. Além de sua capacidade de geração de imagens, análise de microsonda nuclear também oferece possibilidades de quantificação dos elementos químicos que entram na composição de uma amostra biológica. No presente trabalho, estudamos as populações de células humanas e voltada para a análise de uma região escolhida de interesse com base em uma única célula …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Serge Borderes direção e edição do vídeo. A agência francesa de investigação nacional apoia o programa de pesquisa TITÂNIOS (ANR CES 2010, n ° CESA 01 009). O CNRS e a Comunidade Europeia como uma atividade de integração desde o “apoio de público e Industrial pesquisa usando íon feixe tecnologia (espírito)” sob o contrato CE n ° 227012. Este trabalho foi apoiado por acções Marie Curie – redes de formação inicial (ITN) como um “integrando atividade apoio pós-graduação com estágios na indústria e treinamento excelência em pesquisa” (SPRITE, D1.3) sob contrato CE n. º 317169. O C’NANO Grand Sud Ouest e a região Aquitânia apoiar o programa de pesquisa TOX-NANO (n ° 20111201003) e o programa de pesquisa POPRA (n ° 14006636-034).
Materials
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
Riferimenti
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