Визуализации Металлы в ткани головного мозга методом лазерной абляции - индуктивно связанной плазмы - масс-спектрометрии (LA-ICP-MS)

Summary

Количественно отображение металлов в ткани методом лазерной абляции – с индуктивно связанной плазмой – масс-спектрометрии (LA-ICP-MS) является чувствительным аналитический метод, который может обеспечить новое понимание того, как металлы участвуют в нормальной функции и болезни процессов. Здесь мы опишем протокол для количественной визуализации металлов в тонких срезов мышиного неврологического ткани.

Abstract

Металлы встречаются повсеместно по всему организму, с их биологической роли диктуемого как их химической реакционной способности и обилию в пределах определенной анатомической области. В головном мозге, металлы имеют весьма разобщенным распределение, в зависимости от основной функции, которую они играют в центральной нервной системе. Визуализация пространственного распределения металлов обеспечило уникальное понимание биохимического архитектуры головного мозга, что позволяет прямую корреляцию между нейроанатомической регионов и их известной функции в отношении металлических нестационарных процессов. Кроме того, несколько возрастных неврологических расстройств Функция нарушается гомеостаз металла, который часто ограничивается мелкими областями мозга, которые в противном случае трудно анализировать. Здесь мы опишем комплексный метод количественного визуализации металлов в мозге мыши, с помощью лазерной абляции – с индуктивно связанной плазмой – масс-спектрометрии (LA-ICP-MS) и обработку специально разработанные изображенияпрограммного обеспечения. Сосредоточение внимания на железо, медь и цинк, которые являются три из наиболее распространенных и болезненных релевантных металлов в головном мозге, мы опишем основные этапы подготовки проб, анализа, количественных измерений и обработки изображения для получения карт распределения металла в низкой микрометра диапазон разрешения. Этот метод, применим к любой секции разрез ткани, способна демонстрировать сильно изменяющимися распределение металлов в органе или системе, и могут быть использованы для выявления изменений в металлическом гомеостаза и абсолютные уровни в пределах тонких анатомических структур.

Introduction

Уникальный окислительно-восстановительной химии металлов способствует целый ряд неврологических функций, включая передачу сигнала, производства энергии и синтеза нейромедиаторов. В ряде крупных нейродегенеративных заболеваний, dyshomeostasis из этих металлов были и замешаны в патогенезе заболевания и идентифицированы как потенциальные мишени новых для терапевтического вмешательства ^1. Для того, чтобы лучше понять, как металлы участвуют в таких условиях, как болезнь Альцгеймера и Паркинсона (AD и PD, соответственно), крайне важно, чтобы иметь возможность измерить как распределение металла и уровни изменяться в регионах, пострадавших от процесса заболевания. Эти изменения часто указывают на тонкие изменения в биохимических реакций , которые могут быть тесно связаны с процессами , которые инициируют гибель клеток, таких , как недавно предложенного нами механизма железа и дофамина нейротоксичности в PD ^2.

Традиционно, метаУровни л в пределах определенных анатомических областей было достигнуто за счет тщательного иссечения, пищеварения и анализа с использованием целого ряда аналитических методов ^3. Тем не менее, такой подход теряет пространственную информацию, которая может иметь решающее значение при болезненных состояниях расследуются связаны с небольшими, четко определенных регионов или конкретных типов клеток. Ряд аналитических методов доступны для визуализации металлов в биологических системах, от неповрежденных образцов до срезов тканей , так и в двух и трех измерениях, используя эмиссионной спектроскопии, флуоресцентных зондов и масс – спектрометрии ^4. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки в отношении чувствительности, селективности химических частиц, и пространственное разрешение, которое может быть достигнуто. Для полного обзора ассортимента доступных методов, см обзор по Hare и соавт. ^5.

Масс-спектрометрия (МС) основе методы являются наиболее чувствительными из этих методов, Способный измерять наиболее биологически соответствующих металлов при их концентрации нативного ^6. Лазерная абляция – с индуктивно связанной плазмой – масс-спектрометрии (LA-ICP-MS) формирования изображения используется сфокусированный ультрафиолетовый лазерный луч размером от 1 до> 100 мкм в диаметре (или ширины, когда используется четырехугольная форма пучка), в соответствии с которым проба проходит ^7. Количественная информация может быть достигнуто за счет репрезентативной абляции стандартных справочных материалов, которые могут быть получены с использованием различных подходов , различающихся ^8, каждый с разной степенью технической сложности и аналитической практичности. Наиболее общий подход использует матрицу-соответствия, где стандартная с преимущественным химического состава сравнима с таковой образца получают путем пики с целевым анализируемым веществом и точно оценены по однородности и абсолютной концентрации металлов с помощью независимых аналитических средств ^9, </suр> ^10. Абляция подготовленных стандартов может затем использоваться для внешних целей калибровки, что позволяет концентрации данных из полученного изображения образца быть извлечены на пиксель.

Разрешение изображения определяется как размер пучка и скорости, при которой образец сканируют. Стандартный квадрупольного дизайн ICP-MS ( на долю которых приходится более 90% всех установленных систем ICP-MS по всему миру ¹¹⁾ представляет собой последовательный масс – анализатор, в том , что циклы детектора массы через всех выбранных отношения массы к заряду (м / г ), а не сбор данных одновременно. Таким образом, время сбора для каждого цикла масс должны приравнять ко времени , затраченному для образца , чтобы пройти через одну ширину лазерного луча , чтобы обеспечить пиксель представитель требуемого разрешения приобретается ^12. Лазерный луч выбора размера является важным параметром, который оказывает значительное влияние на чувствительность как и общее время анализа. Как лазерной абляции physiчески удаляет материал, который заметен на ИСП-МС с помощью газа-носителя аргон, количество вещества, которое может быть физически обнаружены масс-анализатора следует закону обратных квадратов. Например, уменьшение диаметра лазерного луча от 50 – 25 мкм приводит к снижению абляцированную материала в четыре раза. Кроме того, в качестве способа сканирования, меньшие диаметры пучков увеличивают общее время, необходимое для абляции выбранной области. Таким образом, экспериментальная конструкция имеет важное значение, чтобы сбалансировать необходимое пространственное разрешение с потребностями чувствительности и временных ограничений.

Обработки изображений с помощью LA-ICP-MS была применена к ряду образцов, матриц и болезненных состояний, в том числе на животных моделях неврологических расстройств ^{13, 14,} черепно – мозговая травма ^15, распределение содержащего металл противораковые препараты ^16, токсикантов воздействия в плаценте ¹⁷ и металла Распределителиibution в зубах, как биомаркера ранней жизни диетических переходов. ¹⁸ В этом протоколе мы опишем общий метод получения изображения железа, меди и цинка в головном мозге мышей WT при разрешении 30 мкм, хотя она может быть легко адаптирована к различным типам образцов и экспериментальных результатов, основываясь на нуждах аналитик.

Protocol

Процедуры, описанные выше, были одобрены Комитетом по Флори животных по этике и придерживаться стандартов Национального исследовательского совета по здравоохранению и медицинским ухода за животными. 1. Подготовка пробы для анализа Примечание: Этот шаг зависит от матрицы анализируемого образца. Подготовка проб и секционирования Примечание: Фиксирование с использованием 4% параформальдегида (PFA) и криозащиты в 30% сахарозы в 0,1 М PBS, будет приводить к различным количеством выщелачивании металлов из ткани. См Hare и соавт 19 для конкретных деталей. Убедитесь, что все образцы прошли идентичные фиксации и криозащиты шаги. Транскардиальную заливать эвтаназии животное с ледяной 0,1 М PBS, рН 7,4 (см раздел методов в Dodt и др. 20 для получения информации) и извлечь мозг. Поместите мозг в 4% PFA O / N, чтобы зафиксировать ткань. <li> Cryoprotect мозг, поместив его в 30% сахарозы в 0,1 М PBS в течение 24 ч, а затем изменить на свежий 30% сахарозы в течение еще 24 ч. 19 Замораживание мозг в криостате при -20 ° С в течение не менее 1 ч. Установите мозг на патроне с помощью подходящего монтажного среды. Раздел мозг на криостат с использованием безметаллический одноразового лезвия (например, политетрафторэтилена [PTFE] -покрытие ножи) и смонтировать на стандартном предметном стекле микроскопа. Оптимальная толщина для секции должна составлять приблизительно 30 мкм. При использовании залитых парафином образцов, раздел в нужной толщины, поплавок ленту на ванну с теплой водой и смонтировать на стандартные предметные стекла микроскопа. Примечание: Точные эффекты долгосрочной фиксации и парафином вложения биологических образцов не известны. Как описано в разделе 1.1, убедитесь, что все образцы прошли идентичные процедуры подготовки образца, если сравнительный анализ предназначен. депарафинизации годовыхRaffin встраиваемый образцы путем погружения слайда в 3 смены ксилола, 1 смена каждого из: 100% этанола, 95% этанола, 70% этанола и минимум 3 изменений в ISO 3696 или эквивалентной очищенной воды (далее именуемые " вода '; см Hare и соавт 21 для детального метода).. Разрешить образцы высохнуть на воздухе в течение приблизительно 1 ч в среде без пыли, таких как бокс слайдов с образцами, размещенных вертикально в стойках и крышке левой приоткрыта. 2. Получение матричных соответствием стандартам Примечание: Ниже приводится краткое протокол ранее опубликована 9. Пожалуйста, обратитесь к оригинальный документ для детальных шагов по подготовке стандартов ткани матрицы соответствием. Получить коммерческие мозги ягненка (или аналогичный) и промыть в воде, удаляя всю кровь и соединительную ткань. Используя скальпель, тщательно препарировать примерно 50 г коры головного мозга Tissuе и частично гомогенизируют с помощью ручного гомогенизатора ткани с поликарбонатной одноразового зонда на малой мощности. Разделить на 5 г аликвоты, с номером в зависимости от диапазона калибровки и число точек калибровки желательно. Подготовка растворов металлов к спайку каждого стандарта путем растворения растворимой соли каждого анализируемого вещества (например, FeSO 4 · H 2 O) в 1% азотной кислоты с получением 0,1, 1 и 100 мг металла мл -1 запасов. Добавление предварительно рассчитанным объем исходного раствора в 5 г на аликвоты ткани (например, 5 мкл 10 мг мл -1 для приблизительного конечной концентрации 10 мкг г -1 сырой ткани) для достижения диапазона колосовых уровней атомов металла в каждый стандарт. В зависимости от требуемой конечной концентрации каждого стандарта, используют комбинацию каждого металла маточного раствора, чтобы обеспечить минимальное количество решений добавляются к стандарту. Добавить последний всплеск воды для каждого стандарта, чтобы гарантировать, следуОбъемы валентных добавленной жидкости присутствует в каждом стандарте. Перемешать зубчатым стандарты на малой мощности в течение примерно 30 секунд. Если не будет использоваться сразу, хранить замороженными при -20 ° С в полипропиленовые пробирки крышками запечатанных парафильмом. Определить точную концентрацию и однородность каждого стандарта с использованием любого из следующих способов: Микроволновая печь пищеварения Поместите 6 точно взвешивают (примерно 50 мг) аликвоты стандарта в вымытые PTFE сбраживания сосуд и добавляют 4 мл концентрированной (65%) азотной кислоты и 1 мл 30% -ной перекиси водорода. Уплотнение и переваривать при 500 Вт в течение 30 мин. После охлаждения переваривания сосуд, открытый в вытяжном шкафу и количественно перенести переваренной решение кислотосвязывающего промывали 50 мл пробирку с использованием 10 мл аликвотами воды. Сделать приблизительно до 50 мл, и точно взвешивают массу конечного раствора. Повторите шаги 2.5.1.1 – 2.5.1.2 для каждого стандарта. Используйте следующую процедуру, если микроволновое переваривание оборудование не доступно: Поместите шесть точно измерить (между 25 – 200 мг) аликвоты стандарта в кислотно-промытый / безметального полипропиленовую трубку и лиофилизации O / N. Добавьте 40 мкл концентрированной азотной кислоты и тепла, раскрытый, на нагревательном блоке до 70 ° С в течение 5 мин, а затем добавляют 10 мкл 30% перекиси водорода. Тепло еще в течение 5 мин, а затем аккуратно сделать до 1 мл общего объема с использованием 950 мкл 1% -ной азотной кислоты. Примечание: Желательно, чтобы переварить сертифицированный справочный материал с использованием метода выбора для обеспечения процедуры пищеварения являются точными. Определить концентрацию металла в каждом растворе дайджеста по распыляемого раствора ИСП-МС с использованием стандартного протокола. Оценка однородности каждого стандарта путем определения относительного стандартного отклонения (RSD%) между каждой аликвоты. Обеспечить% RSDS все падение в пределах 15%. Используя измеренную массу еач аликвоту, вычислить точную концентрацию металла каждого стандарта гомогенизированной ткани. Возвращаясь к стандарту гомогенизированной ткани, пакет 5 х 5 мм пластиковые одноразовые гистологии форму и замораживать в изо -пентана охлаждают в жидком азоте. Удалить Замороженную стандартный блок ткани из формы и секции на криостате при той же толщины, что и образец. Примечание: Рекомендуется подготовить количество секций при различной толщины для будущих экспериментов. Air высушенных стандарты могут храниться бесконечно в герметичном контейнере и пыли. 3. Подготовка LA-ICP-MS для анализа Место стандарты и образцы в абляции камере, гарантируя, что они находятся в пределах глубины резкости ПЗС-камеры, установленной на устройстве LA. Если настройка прибора необходимо, включать соответствующий справочный материал (например, NIST 612 микроэлементами в стекле). Закрутите два винта на двери камеры, чтобы запечатать йэлектронной абляции камеры. В программе ICP-MS, выберите открытый газовый клапан аргона в «Техническое обслуживание» или аналогичной панели и установите поток газа – носителя до 1,2 л мин -1 в соответствующем диалоговом окне. Примечание: В данном протоколе используется аргон в качестве газа-носителя. Несколько примеров используют гелий или смесь гелия и аргона в качестве газа-носителя. См Гюнтер и Генрих 22 для технических деталей для использования гелия и аргона смесей в качестве аэрозольного газа – носителя. В программном обеспечении LA, нажмите на кнопку «очистить», чтобы промыть клетки с аргоном в течение как минимум 30 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Время продувки может быть изменен, нажав «очистить время» или аналогичную кнопку. При использовании системы абляции с абляции клетки двухтомнике, периодически перемещать сцену в каждом углу и по диагонали пересекают клетку, чтобы обеспечить столько, остаточный воздух удаляется из клетки, как это возможно. Это может быть достигнуто путем выбора «дома» или этапы эквивлентным функция. Включите ICP-MS, нажав 'плазмы на' и позволяют разогреть в течение двух часов, в течение которых ступает 3.5 – 4.4 можно проводить. Установки прибора варьируются от разных производителей, хотя пример соответствующих условий эксплуатации ЛА-ИСП-МС можно найти в Hare и соавт. 10. Представитель абляция стандартов тканей Выберите инструмент линии и нарисуйте одну строку абляции приблизительно 3 мм длиной по всей поверхности ткани. Установите параметры следующим образом, щелкнув правой кнопкой мыши на строку абляции в списке экспериментов и изменения следующие: диаметр луча (выбранный в зависимости от обстоятельств пользователем; квадратный пучок 30 мкм используется здесь), скорость сканирования (в 4 раза диаметр луча в секунду; 120 мкм с -1) и плотности потока энергии (0,3 -0,5 J см -2 для мягких тканей; оптимизировать при необходимости для более твердых матриц). При толщине 30 мкм ткани лазерный луч не проникает в полной thickness этой ткани, устраняя любые потенциальные загр знени из поддержки микроскопа. Нормализация к углероду 23 может быть использован для коррекции изменения в объеме ткани абляции. Установите эти параметры по умолчанию для каждой последующей строки, нажав кнопку "По умолчанию" радио. Дубликат этой линии шесть раз, выбрав начальную строку, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав пункт "Дублировать сканирование". Убедитесь , что линии смещены либо Х – или y- оси диаметра пучка. Это дает в общей сложности семь линий в соответствии со стандартом, разнесенных в зависимости от диаметра пучка. Повторите шаги 3.5.1 – 3.5.3 для каждого стандарта, обеспечивая линии одинаковой длины. Чтобы нарисовать область абляции по образцу, по одной из двух следующих способов: Примечание: Убедитесь, что одни и те же параметры сканирования (диаметр луча, скорость сканирования, плотности энергии) используются для выборки строк. Если система LA оснащенаширокого поля зрения, выберите инструмент линии и нарисуйте линию от верхнего левого угла образца достаточно долго, чтобы покрыть образец в самом широком месте, используя те же параметры лазера, описанные в 3.5. Дублирование это сканирование, как описано в разделе 3.5.3 с линиями, разнесенных в зависимости от диаметра луча столько раз, сколько необходимо для обеспечения полного охвата образца. Если широкое поле обзора не доступна, определить и записать координаты х и у ( как правило , отображается на главном экране , как «положение ступени» или аналогичный) , соответствующие углам прямоугольника , охватывающего весь образец. Используйте эти координаты для позиционирования параллельных линий абляции, охватывающих всю область образца, как описано в 3.7.1. Рисовать линии для периодического сканирования стандартов самое позднее после ~ 20 ч сканирования образца, повторяя процесс, описанный в 3.5. В зависимости от длительности сканирования образца этого может потребоваться несколько раз. Завершение эксперимента с дополниного сканирования стандартов. Примечание: При определении координаты х и у , а ячейка очищается, выбирая исходное положение и связанное с ним калибровка оси изменит ранее приобрела специфические для координаты х и у , тогда разность (т.е. длина линии) будет не затрагивается. 4. Настройка данных методов сбора для ИСП-МС Для стандартной линии абляции, разделите длину линии от скорости лазерного сканирования, чтобы определить общее время анализа для одной линии. Повторите эту процедуру для образца линии. В программном обеспечении ICP-MS, создать новый метод (показанный здесь как "партии") и убедитесь, что "время разрешен анализ" или выбран эквивалент. Выберите значения m / z, чтобы обнаружить, а затем настроить время интегрирования для каждого т / г, так что общее время интегрирования для одного цикла составляет 0,25 с. Нажмите кнопку "Сохранить Batч Как 'и имя соответственно (например, STD1). Примечание: По мере того как образец будет проходить лазерный луч в четыре раза больше диаметра пучка, что обеспечивает точка данных для каждой массы записывается эквивалентно диаметру пучка 12. Например, используя размер 100 мкм пятно, скорость сканирования 400 мкм с -1 со временем интегрирования 0,25 сек будет производить изображения с истинными размерами пикселей. Время интегрирования может быть отрегулирован для повышения чувствительности; при увеличении времени интегрирования скорости сканирования 0,33 сек должно быть замедлено в три раза диаметра пучка. Для стандартов, введите время анализа для каждой линии сканирования в соответствующем поле, плюс дополнительные 15 секунд для учета лазерного прогрева и время размыва. Введите пример списка Запуск (т.е. порядок , в котором запускаются сканирование) с таким же числом приобретений (обычно нумеруются последовательно, то есть 001, 002 и т.д.), от общего количества стандартных линий. Для получения образца, Дублировать метод, используемый для стандартов, сохранив текущий метод или партии с альтернативным именем файла, а также настроить общее время приобретения (в том числе дополнительных 15 с) и общее количество приобретений, чтобы соответствовать количеству линий, которые будут абляции образца , Примечание: В большинстве систем LA-ICP-MS используют односторонний триггер (LA запускающее ICP-MS), важно, чтобы программное обеспечение ИСП-МС ожидает спусковой крючок от Лос-Анджелеса до последующей линии абляция начинается. Окно Приобретение ICP-MS прочтет "ждет старта". 5. Запуск эксперимента Запуск очереди ICP-MS путем добавления первого метода или пакета в очереди и обеспечить программное обеспечение ожидает спусковой механизм из системы ЛА. В программном обеспечении LA, включите лазерный источник питания, нажав кнопку "выбросов", нажмите кнопку "Выполнить" и установить время лазерного прогрева до 10 сек и вымывания время до 20 с в соответствующих полях. Примечание: Это будет перерасходобеспечить ICP-MS готова начать получение новых данных, когда лазер начинает каждую последующую линию абляции. Начало лазерной последовательности, нажав кнопку «Пуск». При использовании двухтомный клетки, обеспечить образец чашки находится в положении. 6. Расчет Количественное определение стандартов Примечание: Есть несколько вариантов для преобразования данных ICP-MS в образы. Они включают в себя использование самодельных программных средств , написанных на языках с открытым исходным кодом 17, 24, 25, 26 коммерческих макросов и данных программного обеспечения для анализа. 7 Здесь, использовать недавно разработанный программный модуль ( как описано в Paul и др. 27), основанный на специализированном LA-ICP-MS анализа данных набора 28. Перенесите все папки , содержащие пакетные данные Run (001.d, 002.d и др.) На котдельный компьютер с программным обеспечением для анализа установлено. Извлечение файлов данных * .csv для каждой линии партии в отдельную папку. Примечание: Использование сценария для автоматической передачи файлов * .csv в новую папку, настоятельно рекомендуется. Смотрите приложенный код Python для более подробной информации. Этот сценарий был написан в соответствии с либо Agilent 7700 или 8800 Series ICP-MS, но могут быть изменены в соответствии с выходной файл от других производителей. Откройте программную платформу и следуйте Вкладки последовательно импортировать и анализировать стандарты для получения количественных изображений, как описано ниже. Чтобы импортировать данные из первого стандартного пакета, выберите 'Agilent .csv' для 'Тип файла', 'всю папку' для 'типа Import' и убедитесь, что 'Формат даты' совпадает с форматом компьютера. Нажмите кнопку "Импорт", выберите папку, содержащую .csv-файлы для первого набора стандартов, и перейти на вкладку "Исходные данные". базовая линиявычитание Используйте вкладку "Автоматическая опциям пункта (команда 2) из ​​главного меню приложения выпадающего на панели инструментов, выберите« Информация от импорта "и нажмите кнопку" Продолжить ". Нажмите кнопку "Выбрать все" и выберите "Baseline_1" для интеграции. Для того, чтобы выбрать первые 10 секунд каждой строки развертки (соответствующего лазерного времени прогрева), обрезать данные путем ввода второго значения '0' и '(продолжительность линии – 10 сек) "и нажмите кнопку" Добавить интеграций "(например , , для линии сканирования 35 сек, введите значения '0' и '25'). Чтобы выбрать образец данных, используйте вкладку "Автоматическая опциям пункта, как описано в 6.4, но выбрать 'OUTPUT_1', как интеграция. Crop данные с начала и конца каждой стандартной линии , чтобы исключить фоновый сигнал (например , для линии сканирования 35 сек, введите значения '13' и '4'). Чтобы исключить капли в сигнале, вызванного возмождаемых отверстия в стандартах, на вкладке "Samples", нажмите кнопку "каналы" в верхнем левом углу области графика , чтобы выбрать канал с высоким отношением сигнал-шум (например, С13 или Р31). Запишите каких-либо резких перепадов сигнала и выберите значение CPS на достаточно низком уровне, что находится ниже нормальной вариации в образцах, но достаточно высоко, чтобы выбрать самые резкие перепады в сигнале. Перейдите на вкладку "DRS 'и выберите' Baseline_Subtract 'для' схемы редукции данных Current '. Выберите канал из 6.6 для 'Index Channel' и значение CPS для "Порог для использования при низких маскирующие сигналы. Вставьте значение <0,5 с для 'секунд, чтобы обрезать до / после низких сигналов "для учета задержки в передаче сигнала от лазера к ИСП-МС. Для того, чтобы подтвердить адекватную маскирование районах с низким уровнем сигнала, нажмите кнопку Назад на вкладку "Samples" и выберите след канала обрабатываются (например., Fe56_CPS). Повторите результаты КПА и & #39; секунды, чтобы обрезать до / после значений сигналов низкого ', как в 6.7, если это необходимо. Перейдите на вкладку "Результаты" и выберите "Экспорт данных" из главного меню приложения в раскрывающемся меню. Введите имя файла для создания файла таблицы данных результатов (например, расчеты STD1, Std2 …). Откройте файл данных в подходящей программе электронных таблиц и вычислить значения CPS для каждого отдельного канала будет количественному. С помощью заранее заданных концентраций металлов из раствора ингаляторы ICP-MS для расчета коэффициента преобразования из значений СУЗ в ppm (мкг г -1) для каждого количественному элемента. Повторите шаги 6.3 – 6.10 для всех наборов стандартов в перспективе. 7. Построение количественных изображений Написать 'биотит ()' в командной строке, чтобы открыть программное обеспечение. Импорт образец данных, нажав "Load Images" и выберите папку, содержащую файлы .csv-FOг изображение образца. коррекция фона Перейдите на вкладку "Исходные данные", чтобы применить коррекцию фона для образца. На фосфора (Р31) изображение будет предложено на экране, выберите участки фона с помощью инструмента прямоугольник дро. Выбор, как многие регионы, как это возможно создает изображение в масштабе карта сигнала дрейфа / плазмы, чтобы обеспечить адекватную компенсацию от этих искажающих факторов. Для того, чтобы фоновый сигнал более видимым, выберите инструмент редактирования графа (вверху слева от отображаемого изображения) и щелкните правой кнопкой мыши на изображение. Выберите "Изменить внешний вид изображения" и изменить 'Первый цвет при Z =' к большим отрицательным значением (например , -100,000). Продолжайте, нажав кнопку "Готово". Перейдите на вкладку "стандарты", чтобы открыть таблицу для коэффициентов коррекции CPS / частей на миллион. Введите значения, вычисленные по стандартам на этапе 6.10 для каждого из элементов. Этот шаг поможет исправить дрейфа чувствительности в ИСП-МС. Нажмите кнопку "Go! ' Открыть "Браузер данных" на вкладке "Data ', который содержит изображения для каждого элемента и каждого шага. Для того, чтобы завершить изображение для экспорта, выберите нужное изображение в папке "StdCorrImages", щелкните правой кнопкой мыши имя изображения (* _ppm) и нажмите кнопку 'NewImage'. Щелкните правой кнопкой мыши на изображение, чтобы открыть "Изменить внешний вид изображения", чтобы выбрать нужный цвет таблицы и цветовую гамму. Добавить цветовую шкалу к изображению, щелкнув правой кнопкой мыши на изображение и выберите "Добавить аннотацию". Выберите 'ColorScale' из верхнего левого выпадающего меню и использовать вкладки для изменения желаемого цвета шкалы. Для того, чтобы экспортировать изображение, убедитесь, что изображение в вопросе выбора и перейдите на вкладку "Файл" и нажмите "Сохранить графику … '. Выберите нужный формат и сохранить изображение. В качестве альтернативы, выбранное изображение может быть передан с помощью функции копирования и вставки инструментов. Повторите шаги 7.6 и 7.7 для всех изображений, представляющих интерес. Quantifлнение дискретных областей Для активации ROI инструментов, перейдите к 'Analysis' вкладке "Пакеты" и выберите "Обработка изображений". Выберите нужное изображение и перейдите на вкладку "Изображение" и выберите "ROI … '. Нажмите кнопку "Пуск" ROI рисовать и использовать инструмент для рисования, чтобы выбрать интересующую область в образце. Чтобы закончить рисунок, нажмите кнопку "Готово" ROI. Для того, чтобы получить статистику для выбранной ROI, перейдите на вкладку "Изображение" и нажмите кнопку "Статистика …". Скопируйте и вставьте результаты в отдельной таблице. Повторите выбор ROI (7.9.2) для всех регионов и элементов, представляющих интерес.

Representative Results

Для демонстрации возможностей такого подхода визуализации LA-ICP-MS, простой эксперимент с использованием одного сечение / 6 мозга мыши WT C57BL, на пополам мозолистого тела и секционного в корональной плоскости, представлена. Последовательность действий для анализа данных с использованием биотит (Рисунок 1), как описано в разделах 6 и 7, а также для обеспечения представительного изображения распределения металла в секции анализируемой (рисунок 2) также описано. Как можно видеть, распределение металла в головном мозге мыши изменяется в зависимости от анатомической области. Это может быть связано с переменной ролями металлов, и более конкретно белки , к которым они присоединены, играть в каждом регионе мозга 27. Например, железо имеет тенденцию иметь более высокие концентрации в мозге и вдоль зубчатую извилину, в то время как цинк наиболее обильна в Кортиевческие районы. Углерод, который обычно используется внутренний стандарт 8, гомогенно распределены. Элементарные карты (рисунок 2) , может быть особенно полезным при использовании в сочетании с существующими анатомическими и функциональными ссылочных атласам 29, где информация о колокализации металлов может экспрессия специфических металлов-связывающих белков могут дать представление функции металлов в головном мозге региона или изменения уровня металла в соответствии с выявленной болезни, связанные с биомолекулы. Используя подход, описанный, который оптимизирован для более широкого спектра анализируемых веществ, не исключает чувствительности к низким элементов численности, таких как марганец, и методы могут быть приспособлены, чтобы сосредоточиться в первую очередь на этом аналита путем увеличения времени обитать за счет других измеренных масс. Основное преимущество при использовании изображений с помощью LA-ICP-MS наблюдает относительные различия в металлических Концвания и распределения между экспериментальными группами. Ранее мы уже использовали такую технику , чтобы продемонстрировать повышенное железо следующее нейротоксин оскорбление , имитирующей PD 2, 10, а также изменения в корковых уровней железа в ткани 21 заболевание человека Альцгеймера. Такой протокол, как описано здесь, может быть легко адаптирована к любому другому типу ткани с минимальным поправками к перечисленным методам. Рисунок 1: Последовательность действий при обработке изображений. Рабочий процесс комплементарной секций 6 и 7, изображающих превращение сырого времени решенных данных от ICP-MS для количественного изображений распределения металла в мозге мыши. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. </p> Рисунок 2: Типичная Elemental Распределение биометаллами в головном мозге мышей. Представительные карты элементом 30 мкм толщиной корональной части одного полушария мозга мыши анализировали с использованием LA-ICP-MS. Изображения для углерода-13 (C13), магний-24 (Mg24) и фосфора-31 (P31) отображается в золотой цвет шкал (число импульсов в секунду, ХП) (верхний ряд). Количественные изображения (нижний ряд) для марганцево-55 (Мп55), медь-63 (Си63), железо-56 (Fe56) и цинк-66 (Zn66) отображаются с соответствующими цветовыми шкалами BlueHot (мкг г -1). Общее время анализа для участка мозга был приблизительно 5 ч. Шкала бар = 2 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <strong> Дополнительный код файла 1. Открытый исходный код Python , описанный в пункте 6.1, который может быть изменен с помощью соответствующего редактора Python в соответствии с методом ICP-MS изготовителя вывода данных. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Визуализации металлов в неврологической ткани является лишь одним примером того, как этот протокол может предоставить полезную информацию о распределении и количестве металлов в любой биологической матрице. Несмотря на то, подготовка стандартных справочных материалов может быть трудным, это эксперимент, который может быть выполнен один раз и архивировать для последующего использования.

LA-ICP-MS имеет определенные преимущества по сравнению с альтернативными методами, такими как синхротронное на основе рентгеновской флуоресцентной микроскопии, в основном с точки зрения доступности и чувствительности. Тем не менее, есть определенные недостатки , которые следует учитывать при подготовке эксперимента с использованием LA-ICP-MS, и как таковое оно часто является полезным комплементарный метод химической обработки изображений , которая включает в себя альтернативные методы анализа металла, а также сравнительный гистохимии ^5.

Согласование с известными анатомическими особенностями мозга мыши может дать полезную информацию о возможной функциональной отношений Типыonship между уровнями металла и пространственного распределения. Ранее мы использовали Allen Brain Atlas онлайн – ресурс, ²⁹ , который является хранилищем открытого доступа обоих анатомических и генетических данных экспрессии в головном мозге мышей C57BL / 6 для изучения пространственной корреляции как экспрессии фермента металло-зависимой ¹⁴ и нейроанатомии ^{27, 30.} Другие ресурсы, такие как верстаке Грызун мозга ³¹ также доступны , чтобы помочь с регистрацией и выравнивания металлических изображений , чтобы помочь в правильной идентификации распределения металла в часто мелких анатомических областях.

Применение этой методики полезны при оценке того, как металл уровней и изменение распределения на микроуровне на протяжении двух нормальных жизненных событий (например, старение) и при болезненных состояниях; а также изучение влияния обоих металлсодержащих соединений и лекарственных средств, предназначенных для целевой менятал метаболизм. В настоящее время основные ограничения LA-ICP-MS в качестве метода визуализации для оценки пространственно распределения металла являются пропускная способность и чувствительность. Существует компромисс между скоростью анализа и пространственным разрешением ^{5, 12,} с изображениями с более высоким разрешением , требующих более длительного времени анализа. Метод хорошо подходит для биологических элементов при более высоких концентрациях, хотя элементы, такие как марганец, кобальт и селен ограничены из-за их низкой численности в нормальной ткани и / или ограничений в их обнаружения с помощью обычных ICP-MS. Новые достижения в области технологии ICP-MS, такие как введение тройного квадрупольного масс – анализаторов, позволяют целенаправленного обнаружения сложных аналитов, таких как селен ³² при высокой светочувствительности ^33. В качестве процедуры технологии управляемой, достижения в области как лазер и масс-спектрометрии дизайн будет видеть эту визуализацию технику продолжают развиваться, увеличиваяскорость анализа и чувствительности ^34.

Materials

Soda glass microscope slides	n/a	n/a	Typical slides are suitable for all experiments
PTFE-coated microtome blades	C.L. Stuckey	DT315R50	Blade size depends on cryostat blade holder. Check before ordering.
Parafomaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Any supplier suitable
Sucrose	n/a	n/a	Commercial grade white sugar is suitable
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich	P5368	Pre-mixed sachets listed, can be prepared according to normal laboratory protocols
Xylene	Sigma-Aldrich	247624	Any supplier suitable
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Any supplier suitable
Lamb brain	n/a	n/a	Available from most local butchers
Metal salts	n/a	n/a	Use water soluble metal salts containing desired analytes
Omni TH Tissue Homogeniser	Omni Inc	THP115	Alternative homogenizers are suitable
Polycarbonate homgenizer probes	Omni Inc	TH115-PCRH
Microwave digestion unit	n/a	n/a	Optional. See Section 2
1.5 mL microfuge tubes	TechnoPlas	P4010	Metal-free polypropylene tubes. Acid washed tubes are also suitable
65% nitric acid	Merk Millipore	100441	Trace analysis grade
30% hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	95321	Trace analysis grade
10 x 10 mm disposable cryomolds	Ted Pella	27181
Iso-pentane	Sigma-Aldrich	76871
Liquid nitrogen	n/a	n/a	Use local supplier
NWR213 Laser Ablation system	ESI Ltd	n/a	Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol
Agilent 8800 Series ICP-MS	Agilent Technologies	n/a	Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol
Iolite	Iolite Software	n/a	Available from http://iolite-software.com/. Other methods are available, see protocol
Excel	Microsoft	n/a
IGOR Pro	Wave Metrics	n/a	Avalable from https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm