Härledning av Leptomeninges Explantation kulturer från obduktions Human Brain Donatorer

Summary

Den leptomeninges Explantation kultur protokoll från Human obduktion hjärnan är en tekniskt robust och enkelt sätt att härleda fibronektin-positiva meningeal fibroblaster inom 6-8 veckor och cryopreserve 20-30 miljoner celler.

Abstract

Även om stora framsteg har gjorts i den kliniska karakterisering av Parkinsons sjukdom, flera studier rapporterar att diagnosen av Parkinsons sjukdom inte är patologiskt bekräftad hos upp till 25% av kliniskt diagnostiserade Parkinsons sjukdom. Därför vävnad uppsamlas från kliniskt diagnostiserade patienter med idiopatisk Parkinsons sjukdom kan ha en hög frekvens av fel diagnos; därmed in vitro-studier från sådana vävnader för att studera Parkinsons sjukdom som en preklinisk modell kan bli meningslös.

Genom att samla obduktion mänskliga leptomeninges med en bekräftad neuropatologisk diagnos av Parkinsons sjukdom och kännetecknas av nigrostriatala cellförlust och intracellulära proteininneslutningar kallade Lewy bodies, kan man vara säker på att kliniskt observerade parkinsonism inte orsakas av en annan bakomliggande sjukdomsprocessen (t.ex. tumör, arterioskleros).

Detta protokoll prets dissekering och beredning av postmortem humana leptomeninges för härledning av en meningeal fibroblast kultur. Detta förfarande är robust och har en stor framgång. Utmaningen av kulturen är sterilitet som hjärnan upphandling i allmänhet inte utförs under sterila förhållanden. Därför är det viktigt att komplettera odlingsmediet med en cocktail av penicillin, streptomycin och amfotericin B.

Härledning av meningeal fibroblaster från obduktion bekräftade fall med Parkinsons sjukdom utgör grunden för in vitro-modellering av Parkinsons sjukdom. Meningeal fibroblaster visas 3-9 dygn efter provprepareringen och ca 20-30 miljoner celler kan kryokonserveras i 6-8 veckor. Meningeal fibroblast kulturen är homogen och cellerna uttrycker fibronektin, en vanligen använd markör för att identifiera hjärnhinnorna.

Introduction

Mening består av tre membran som skyddar hjärnan: dura mater, spindelvävshinnan och pia mater. På senare tid har det varit känt att hjärnhinnorna spelar också en viktig roll i hjärnans utveckling och hjärn homeostas ^en. Meninges är härledda från mesenkymal och neurallist-härledda celler, och intressant nog, har det visat sig att progenitorceller som bor i hjärnhinnorna kan ge upphov till neuroner in vitro och efter transplantation in vivo ^{2, 3, 4.} Meninges kulturer har också med framgång använts som matarskikt, eftersom de besitter stromal derived inducerande aktivitet för differentiering av embryonala stamceller i dopaminerga neuroner ^5. Dessutom leptomeninges har potential att direkt differentiera till neuroner, astrocyter och oligodendrocyter i ischemiska tillstånd ^6.

För detta protokoll är Human obduktion meningprover från spindelvävshinnan och pia mater, kollektivt kallas leptomeninges, och upphandlas som en del av en mänsklig hjärna donation för forskningsändamål. Dissekering av hjärnan utförs inom 24 timmar från döden och leptomeninges provet placeras i kallt odlingsmedier för vidare bearbetning inom de närmaste 6-8 h som visas här i detta protokoll.

Detta protokoll beskriver dissekering och beredning av humana mening prover för utveckling av patientens primär leptomeninges cellodling. Vävnaden skärs i 25-30 bitar av ungefär 3 mm x 3 mm rutor. Tre stycken är placerade i varje sex brunnar gelatin-belagda brunnen och hålls nere med runda glas täck. Hjärnhinnorna dissektion tar ca 25-35 min. Den största utmaningen med denna kultur är sterilitet som hjärnan upphandling, transport, och dissektion i allmänhet inte utförs under sterila förhållanden. Thärför, är det viktigt att komplettera odlingsmediet med en cocktail av penicillin, streptomycin och amfotericin B och använda multi-brunnar för att separat kultur vävnadsbitar.

Utväxt av meningeal fibroblaster sker vanligtvis inom den första veckan. Media byts var två till tre dagar tills cellerna är konfluenta och cellerna enzymatiskt passe. Meningeal fibroblaster är frysförvarade på 1 miljon celler per ml / flaska i frysförvaring medier. Med detta protokoll, kan 20-30 miljoner meningeala fibroblaster härledas i 6-8 veckor för frysförvaring. Nedströms tillämpningar av dessa meningeal fibroblaster är primära kulturer för sjukdom forskning, direkt neuronal differentiering eller härledning av inducerade pluripotenta stamceller från leptomeninges för att förstå sjukdomsmekanismer och för läkemedelsutveckling.

Protocol

Hjärnan donation registreringen innehåller dokumentation av registranten sin avsikt att donera. Obduktionen tillstånd för vävnads hämtning tillhandahålls av anhöriga som är tillåtet enligt lag. Forskningsstudier med hjälp av insamlade obduktion exemplar granskas av Institutional Review Board (IRB) för att säkerställa att Health Insurance Bärbarhet och Accountability Act (HIPAA) regler. OBS: Leptomeninges prover samlas in av hjärnan DISSEKTOR eller neuropatologen under en hjä…

Representative Results

När leptomeninges behandlingsprotokoll har varit framgångsrik, först observeras utväxt av meningeal fibroblaster tre till nio dagar efter dissektion, även om detta kan bero på längden av obduktionsintervall för hjärnan. Figur 1 visar meningeal fibroblastkulturer av fyra olika givare. Figur 1A visar en leptomeninges del som hålls nere av en glaskupa slip (mörk diagonal linje) och fibroblast utväxt runt vävnads fyra dagar efter behandling frå…

Discussion

Detta protokoll beskriver en enkel och robust protokoll för att härleda en meningeal fibroblast kultur från Human obduktion leptomeninges samlats i samband med en hjärna donation. Det finns mycket få beskrivningar av protokoll för att härleda cellkulturer från obduktions humant material. Två studier beskriver hud härrörande fibroblastkulturer ^{7, 8, 9,} beskriver en studie dura prov ^10, och en a…

Materials

Corning Petri dishes	Fisher Scientific	351029
Nunc 6-well plate	Fisher Scientific	14-832-11
15-mm cover slips	Fisher Scientific	12-545-83 15CIR-1D
Scalpels, sterile blade, No. 15	Miltex	4-415
Curved precision tip forceps	Fisher Scientific	16-100-122
Serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-11E
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	22-230490
Gelatin	Sigma	G1890-100G
Phosphate Buffer Solution	Fisher Scientific	SH30264.02
Corning 500 mL filter unit	Fisher Scientific	430770	Combine media components and filter.
Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2	Thermo Scientific	178883
Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Media
Hyclone DMEM	Fisher Scientific	SH30081.02
Hyclone FBS	Fisher Scientific	SH30910.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher	11140-050
GlutaMAX Supplement (100x)	Thermo Fisher	35050-061
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher	11360-070
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122
Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL)	Fisher Scientific	BP264520
Bambanker Freeze 120 mL	Fisher Scientific	NC9582225
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibronectin Staining
8 well chamber slides	Fisher Scientific	1256518
20% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15713
Triton X-100	Sigma	T8787
100% Glycerol	BioRad	9455
100% normal goat serum	Fisher Scientific	101098-382
Anti-Fibronectin antibody [F1]	Abcam	ab32419	1:300 dilution in blocking solution
Anti-SERPINH1	Sigma	S5950-200ul	1:250 dilution in blocking solution
Anti-SOX2	Millipore	MAB4343	1:100 dilution in blocking solution
Anti-Nestin	Millipore	MAB5326	1:200 dilution in blocking solution
Anti-TUJ1	Covance	MMS-435P	1:1000 dilution in blocking solution
Alexa Fluor 488 anti-rabbit	Thermo Fisher	A11029	1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm)
Alexa Fluor 555 anti-mouse	Thermo Fisher	A21424	1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm)
Hoechst 33342 stain	Thermo Fisher	H3570	dilute to a final concentration of 1.0 μg/ml; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm)
Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well.