Cell-Free DNA Integritet Analyse i urinprøver
Summary
A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.
Abstract
Selv om tilstedeværelsen af cirkulerende cellefri DNA i plasma eller serum er blevet bredt vist sig at være en egnet kilde af biomarkører for mange typer af cancer, har kun få undersøgelser fokuseret på den potentielle anvendelse af urin cellefrit (UCF) DNA. Med udgangspunkt i de hypoteser, normale apoptotiske celler producerer meget fragmenteret DNA, og at kræftceller slip længere DNA, blev vurderet som en tidlig diagnostisk markør stand til at skelne mellem patienter med prostata- eller blærecancer og raske personer potentielle rolle UCF DNA integritet.
Der foreslås en UCF DNA integritet analyse på grundlag af fire kvantitative realtid PCR'er af fire sekvenser længere end 250 bp: c-myc, BCAS1, HER2, og AR. Sekvenser, der ofte har en øget DNA-kopital i blære og prostatacancer blev valgt til analyse, men metoden er fleksibel, og disse gener kan være substitueret med andre gener af intehvile. Den potentielle anvendelighed af UCF DNA som en kilde til biomarkører er allerede blevet påvist for urologiske maligniteter og dermed bane vejen for yderligere undersøgelser af UCF DNA karakterisering. UCF DNA integritet test har den fordel at være ikke-invasiv, hurtig og let at udføre, med kun et par milliliter urin er nødvendige til gennemførelse af analysen.
Introduction
kan detekteres cellefrie DNA i blod og urin på grund af celledød ved apoptotiske eller nekrotiske mekanismer. Celle-frit DNA i blod er blevet bredt undersøgt til diagnostiske og prognostiske formål i forskellige sygdomme, især kræft 1. Men mindre vides om den rolle, urin celle-fri (UCF) DNA. UCF DNA kan stamme fra blod passerer gennem glomerulær filtration system eller af celler, der kommer direkte i kontakt med denne kropsvæske 2 (f.eks urothelial celler eller prostataceller). Anvendelsen af UCF DNA som en kilde til biomarkører er hovedsageligt blevet undersøgt for tidlig diagnose af nyre-, blære-, og prostatacancer på grund af den høje procentdel af UCF DNA kommer direkte fra urinvejene celler 3,4.
Der vides kun lidt om UCF DNA og de bedste metoder til isolering og karakterisering af det. I betragtning af den hypotese, at tumorceller frigiver længere DNA-fragmenter end normale celler, evalueringenaf cellefri DNA integritet er blevet undersøgt i et forsøg på at belyse oprindelsen af DNA i blodcirkulationen 5. Nogle undersøgelser har vist, at celle-frit DNA integritet i blod udgør en god diagnostisk test for mange typer af cancer 6, og den samme hypotese er blevet foreslået i forbindelse med urin 7-9.
Dette papir beskriver en ny metode til UCF DNA integritet analyse med en potentiel anvendelse til påvisning blære og prostatacancer. Især integritet UCF DNA-fragmenter længere end 250 bp blev testet i 4 regioner, der vides at have en øget DNA kopital i faste tumorer, herunder prostata og blærecancer: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2), og AR (Xq12) 10-14. Specifikke onkogener, snarere end tilfældige sekvenser, blev valgt til at øge sandsynligheden for at finde dem i den cellefrie fraktion af cancerpatienter. En af de største fordele veddenne metode er, at den er fleksibel og at andre regioner kan også vælges på basis af tumortype og karakteristika.
Protocol
Representative Results
Discussion
UCF DNA integrity analysis is a new, non-invasive method for assessing DNA integrity in urine. It was recently proposed for the early diagnosis of bladder9 and prostate cancers7,8. A number of advantages and disadvantages of the UCF DNA integrity test are discussed here, together with future prospects.
The main advantage of the approach is that it offers an inexpensive, non-invasive method and a simple protocol to study urine as a potential source of biomarkers, requiring…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Gráinne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.
Materials
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µl rxns, 2.5 ml (2 x 1.25 ml) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 ml tubes | |||
| incubator | |||
| -80°C freezer | |||
| -20°C freezer | |||
| 10 ul pipette | |||
| 20 ul pipette | |||
| 200 ul pipette | |||
| 1000 ul pipette | |||
| pipette tips (10;20;200;1000) | |||
| 1,5 ml tubes | |||
| 50ml tubes | |||
| 15 ml tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 ml) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 ml) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10ml) | Qiagen | 19133 |
Riferimenti
- Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
- Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential. Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).
- Szarvas, T., et al. Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).
- Togneri, F. S., et al. Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA. Eur.J.Hum.Genet. , (2016).
- Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research. Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).
- Hao, T. B., et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer. Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).
- Salvi, S., et al. Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients. Dis.Markers. 2015, 574120 (2015).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study. Biomed.Res.Int. 2013, 270457 (2013).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data. Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Ishkanian, A. S., et al. High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer. Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).
- Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer. J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).
- Nord, H., et al. Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma. Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).
- Tabach, Y., et al. Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer. PLoS One. 6 (1), e14632 (2011).
