Cell-Free DNA Integrity Analysis i Urinprøver
Summary
A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.
Abstract
Selv om nærværet av sirkulerende celle-frie DNA i plasma eller serum har blitt mye vist seg å være en egnet kilde av biomarkører for mange typer kreft, er det få studier fokusert på den potensielle anvendelse av urin cellefritt (UCF) DNA. Starter fra hypotesene som normale apoptotiske celler produserer svært fragmentert DNA og at kreftceller slipp lenger DNA, den potensielle rolle UCF DNA integritet ble vurdert som en tidlig diagnostisk markør stand til å skille mellom pasienter med prostata eller blærekreft og friske individer.
En UCF DNA integritet analyse er foreslått på bakgrunn av fire kvantitative real-time PCR av fire sekvenser lengre enn 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, og AR. Sekvenser som ofte har et økt DNA-kopi-antall i blære og prostata cancer ble valgt for analyse, men metoden er fleksibel, og disse genene kan bli substituert med andre gener av intehvile. Den potensielle nytten av UCF DNA som en kilde til biomarkører har allerede blitt demonstrert for urologiske kreftformer, og dermed banet vei for videre studier på UCF DNA karakterisering. UCF DNA-integritet test har fordelen av å være ikke-invasiv, hurtig og lett å utføre, med bare noen få milliliter urin som trengs for å utføre analysen.
Introduction
Celle-frie DNA kan påvises i blod og urin på grunn av celledød ved apoptotiske eller nekrotiske mekanismer. Cell-free DNA i blodet har vært mye studert for diagnostiske og prognostiske formål i ulike sykdommer, spesielt kreft en. Men mindre er kjent om rollen til urin celle-fri (UCF) DNA. UCF DNA kan stamme fra blodet som passerer gjennom glomerulær filtreringssystem eller fra celler som kommer direkte i kontakt med denne kroppsvæske 2 (f.eks urotelialceller eller prostata celler). Bruken av UCF DNA som en kilde av biomarkører har hovedsakelig blitt undersøkt for tidlig diagnostisering av nyre-, blære og prostata kreft på grunn av den høye prosentandel av UCF DNA som kommer direkte fra urinveisceller 3,4.
Lite er kjent om UCF DNA og de beste metodene for å isolere og karakterisere det. Gitt den hypotese at tumorceller frigjør lengre DNA-fragmenter enn normale celler, evalueringenav celle-fri DNA-integritet har blitt undersøkt i et forsøk på å belyse opprinnelsen av DNA i blodsirkulasjonen 5. Noen undersøkelser har vist at cellefrie DNA-integritet i blodet representerer en god diagnostisk test for mange typer kreft 6, og det samme hypotese er foreslått i forbindelse med urin 7-9.
Dette notatet beskriver en ny metode for UCF DNA integritet analyse med en potensiell søknad til blære og prostata kreft gjenkjenning. Spesielt integriteten UCF DNA-fragmenter som er lengre enn 250 bp ble testet i 4 områder som er kjent for å ha en øket DNA-kopi-antall i faste tumorer, inkludert prostata og blærekreft: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2), og AR (Xq12) 10-14. Spesifikke onkogener, i stedet for tilfeldige sekvenser, ble valgt for å øke sannsynligheten for å finne dem i den cellefrie fraksjon av kreftpasienter. En av de viktigste fordelene meddenne metoden er at den er fleksibel og at andre regioner kan også velges på basis av tumortype og egenskaper.
Protocol
Representative Results
Discussion
UCF DNA-integritet analyse er en ny, ikke-invasiv metode for å vurdere DNA-integritet i urin. Det ble nylig foreslått for tidlig diagnostisering av blæren 9 og prostata cancer 7,8. En rekke fordeler og ulemper ved UCF DNA integritet test er omtalt her, sammen med fremtidsutsikter.
Den største fordel med metoden er at det gir en billig, ikke-invasiv metode og en enkel protokoll for å studere urin som en potensiell kilde av biomarkører, som krever bare en grunnlegge…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Gráinne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.
Materials
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µl rxns, 2.5 ml (2 x 1.25 ml) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 ml tubes | |||
| incubator | |||
| -80°C freezer | |||
| -20°C freezer | |||
| 10 ul pipette | |||
| 20 ul pipette | |||
| 200 ul pipette | |||
| 1000 ul pipette | |||
| pipette tips (10;20;200;1000) | |||
| 1,5 ml tubes | |||
| 50ml tubes | |||
| 15 ml tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 ml) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 ml) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10ml) | Qiagen | 19133 |
Riferimenti
- Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
- Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential. Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).
- Szarvas, T., et al. Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).
- Togneri, F. S., et al. Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA. Eur.J.Hum.Genet. , (2016).
- Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research. Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).
- Hao, T. B., et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer. Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).
- Salvi, S., et al. Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients. Dis.Markers. 2015, 574120 (2015).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study. Biomed.Res.Int. 2013, 270457 (2013).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data. Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Ishkanian, A. S., et al. High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer. Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).
- Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer. J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).
- Nord, H., et al. Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma. Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).
- Tabach, Y., et al. Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer. PLoS One. 6 (1), e14632 (2011).
