İdrar Örneklerinin Hücre-Free DNA Bütünlüğü Analizi
Summary
A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.
Abstract
plazma ya da serum içinde hücresiz DNA devrede olmasına yaygın birçok kanser türü için biyolojik belirteçler, uygun bir kaynağı olduğu gösterilmiş olmakla birlikte, çok az çalışma idrar hücresiz (Lake Buena Vista) DNA potansiyel kullanımı üzerinde de yoğunlaşmıştır. uzun DNA, prostat veya mesane kanseri ve sağlıklı bireyler olan hastaların ayırt edebilen bir erken tanı markeri olarak değerlendirildi UCF DNA bütünlüğü potansiyel rolü, normal apoptotik hücreler son derece parçalanmış DNA üretmek hipotez ve kanser hücrelerinden serbest bırakılmasına başlatılıyor.
C-myc, BCAS1, HER2 ve Ar: Bir Lake Buena Vista DNA bütünlüğü analizi 250 bp daha uzun dört dizilerin dört gerçek zamanlı kantitatif PCR analizleri bazında önerilmiştir. Sık sık, mesane ve prostat kanserleri artan bir DNA kopya numarası dizileri analiz için seçilmiştir, ancak yöntem esnektir ve bu genler, entegrasyon bölgesinin diğer genler ile ikame edilebilirdinlenme. biyomarkerların kaynağı olarak UCF DNA'nın potansiyel yarar zaten böylece UCF DNA karakterizasyonu üzerine ileri çalışmalar için önünü, ürolojik maligniteler için ortaya konmuştur. UCF DNA bütünlüğü testi non-invaziv, hızlı ve kolay uygulanabilir, analiz gerçekleştirmek için gerekli idrar sadece birkaç mililitre olma avantajına sahiptir.
Introduction
Hücresiz bir DNA ya apoptotik ya da nekrotik mekanizma ile kan ve hücre ölümüne bağlı idrarda tespit edilebilir. Kandaki hücre-serbest DNA çok çeşitli hastalıklarda tanısal ve prognostik amaçlarla özellikle kanser 1 çalışılmıştır. Ancak, daha az idrar hücre içermeyen (UCF) DNA'nın rolü hakkında bilinmektedir. UCF DNA glomerüler filtrasyon sistemi aracılığıyla ya da bu vücut sıvısı 2 (örn ürotelyal hücreler veya prostat hücreleri) ile doğrudan temas içine gelen hücrelerden kan geçen kaynaklanabilir. Biyomarkerların kaynağı olarak UCF DNA kullanımı esas olarak idrar yolu hücrelerinden 3,4 doğrudan gelen UCF DNA yüksek yüzdesi böbrek, mesane ve prostat kanserinin erken tanısı için incelenmiştir.
Küçük UCF DNA ve izole ve karakterize etmek için en iyi yöntemler hakkında bilinmektedir. Değerlendirme tümör hücreleri normal hücrelerden daha uzun DNA fragmanlarını serbest hipotezi göz önüne alındığındahücresiz DNA bütünlüğünü Kan dolaşımı, 5 DNA kökenini aydınlatmak için bir girişim olarak ele alınmıştır. Bazı çalışmalar kanda hücresiz DNA bütünlüğü kanseri 6 birçok türleri iyi bir tanı testi temsil eder ve aynı hipotez idrar 7-9 ile ilişkili olarak önerilmiştir olduğunu göstermiştir.
Bu çalışma, mesane ve prostat kanserinin tespiti için potansiyel bir uygulama ile UCF DNA bütünlüğü analizi için yeni bir yöntem tarif eder. Özellikle, UCF DNA bütünlüğü daha uzun 250 bp prostat ve mesane kanseri dahil olmak üzere katı tümörlerin, artan bir DNA kopya numarası olduğu bilinen 4 bölgelerde test edildi fragmanları: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2) ve Ar (Xq12) 10-14. Belirli onkogenler yerine rastgele diziler, kanser hastalarının hücresiz fraksiyonu bularak olasılığını arttırmak için seçilmiştir. ana avantajlarından biri,bu yöntem, esnek olduğu ve diğer bölgelerde tümör tipi ve özellikleri temelinde seçilebilir olmasıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
UCF DNA bütünlüğü analizi idrar DNA bütünlüğünü değerlendirmek için yeni bir non-invaziv bir yöntemdir. Son zamanlarda mesane 9 ve prostat kanserleri 7,8 erken teşhisi için önerilmiştir. avantajları ve UCF DNA bütünlüğü testi dezavantajları bir dizi birlikte geleceği ile burada tartışılır.
yaklaşımın ana avantajı ucuz, non-invazif bir yöntem ve moleküler biyoloji teknikleri sadece temel bilgi gerektiren biyomarkerların potansiyel bir…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Gráinne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.
Materials
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µl rxns, 2.5 ml (2 x 1.25 ml) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 ml tubes | |||
| incubator | |||
| -80°C freezer | |||
| -20°C freezer | |||
| 10 ul pipette | |||
| 20 ul pipette | |||
| 200 ul pipette | |||
| 1000 ul pipette | |||
| pipette tips (10;20;200;1000) | |||
| 1,5 ml tubes | |||
| 50ml tubes | |||
| 15 ml tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 ml) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 ml) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10ml) | Qiagen | 19133 |
Riferimenti
- Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
- Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential. Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).
- Szarvas, T., et al. Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).
- Togneri, F. S., et al. Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA. Eur.J.Hum.Genet. , (2016).
- Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research. Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).
- Hao, T. B., et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer. Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).
- Salvi, S., et al. Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients. Dis.Markers. 2015, 574120 (2015).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study. Biomed.Res.Int. 2013, 270457 (2013).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data. Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Ishkanian, A. S., et al. High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer. Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).
- Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer. J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).
- Nord, H., et al. Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma. Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).
- Tabach, Y., et al. Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer. PLoS One. 6 (1), e14632 (2011).
