En hurtig, skalerbar fremgangsmåde til isolering, funktionel Study, og analyse af celleafledt ekstracellulære matrix

Summary

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Abstract

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.

Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

Introduction

I de seneste årtier har den ekstracellulære matrix (ECM) blive anerkendt som et mangfoldigt, dynamisk og komplekst miljø, der er involveret i flere celle-fysiologiske og patologiske processer. På vævsniveau ECM'en påvirker cellesignalering, motilitet, differentiering, angiogenese, stamcellebiologi, tumorigenese, fibrose, etc. ^1,2. Studiet af ECM organisation og ECM-afhængige processer har således brede implikationer for cellebiologi og væv fysiologi. For at nå en mekanistisk forståelse af ECM sammensætning, organisation og funktionelle egenskaber, der kræves metoder til nøjagtig isolering af ECM. Ud fra følgende betragtninger tidligste identifikation af ECM-proteiner påberåbes isolation fra væv ^3, har udarbejdelsen af ECM fra dyrkede celler nu blevet mere udbredt.

Isoleringen og analyse af celleafledt ECM er kompliceret af to grunde. For det første er tilstedeværelsen af ​​celler ogIR rigelige intracellulære proteiner kan gøre det vanskeligt at isolere ECM som en diskret ekstracellulære struktur. Faktisk er nogle ECM-proteiner har roller inde i cellen samt i ECM ^4; derfor, effektiv fjernelse af intracellulære proteiner fra celleafledt ECM er afgørende, hvis studiet af proteiner i ECM er ikke at forveksle med deres roller inde i cellen. For det andet er celleafledt ECM består af mange store, oligomere proteiner, som ofte er covalent tværbundet ved ECM samling og er derfor uopløselige i standard detergenter. Disse egenskaber kan komplicere ekstraktion og den videre analyse af ECM. For at løse disse problemer, kræves der en metode, som tillader effektiv adskillelse af ECM-proteiner fra cellulære komponenter.

Adskillige fremgangsmåder er blevet beskrevet i litteraturen til isoleringen af ​​ECM fra enten cellekultur eller vævsekstrakter. Mange af disse metoder er rettet mod udvinding af den rigelige ECM protein, collagen, fra væv og inkluderer anvendelse af neutrale salte ^3, sure betingelser ^5,6, eller pepsin ^7. Isolering af total ECM fra vævsekstrakter involverer ofte decellularization af vævet forud for isoleringen af ​​ECM. For eksempel har en sekventiel ekstraktionsmetode blevet beskrevet som isolerer ECM fra humant hjertevæv ^8. Først blev løst bundne ECM-proteiner ekstraheret med 0,5 M NaCl, før natriumdodecylsulfat (SDS) blev anvendt til at fjerne cellerne. Endelig blev de resterende ECM-proteiner ekstraheret under anvendelse af 4 M guanidin ^8. ECM kan også solubiliseres fra decellulariserede prøver under anvendelse 8 M urinstof ^9. Andre teknikker anvender detergenter, såsom deoxycholsyre ^10, til at udtrække begge celler og ECM før udskillelsen uopløselige ECM-proteiner fra den opløselige cellelysat ved centrifugering.

Metoden til isolering og analyse af celle-afledt ECM er beskrevet i denne rapport indeholder en reproducible fremgangsmåde til fjernelse cellemateriale, hvorefter celle-afledt ECM, der kan analyseres ved in situ immunofluorescens eller ekstraheret til yderligere biokemisk analyse. Denne fremgangsmåde kan tilpasses til andet vedhængende celletype og kan skaleres op for downstream procedurer, såsom immunoblotting eller massespektrometri eller til udnyttelse af det isolerede ECM i funktionelle studier. Fremgangsmåden kan også anvendes i forbindelse med konfokal mikroskopi af levende celler til at spore ECM aflejring af et mærket protein af interesse i realtid. Dette opnås ved anvendelse af en inddelte, glas-bund fad. Samlet set tilgang giver en nøjagtig isolering af celle-afledt ECM og også mulighed for at identificere og overvåge aflejring og dynamik enkelte ECM-proteiner.

Protocol

1. Fjernelse af celler med ammoniumhydroxidopløsning Forbered adhærente celler ved Plating på passende tæthed. BEMÆRK: Cellerne kan være vedhængende celletype, der producerer tilstrækkelig ECM til analyse. Her beskriver vi anvendelsen af ​​COS-7 celler, en afrikansk grøn abenyre fibroblastlignende cellelinie, der indeholder SV-40 virus-DNA-sekvenser; RCS, en rotte chondrosarcoma cellelinie; eller normal human dermal fibroblast (HDF) stammer fra juvenil forhud. HDF anvendes fra passage 1 til kun passage 8. Plate cellerne på dækglas til billeddannelse af levende celler og ECM, for fluorescens mikroskopi studier af fast ECM, eller til forberedelse af celle-afledt ECM for små funktionelle assays. Plate cellerne på cellekultur retter til SDS-PAGE-analyse, immunoblot eller proteomics undersøgelser. BEMÆRK: celledyrkningsbetingelser (antal celler til plade og dyrkningsmedium) vil afhænge af celletypen. Celletallet til pladen skalfastlægges empirisk for den bestemte cellelinje eller cellestamme. Kan være en passende tid for cellerne til at deponere ECM, typisk> 16 timer. BEMÆRK: Tidsrummet vil afhænge af celletype og skal bestemmes empirisk. Hvis udførelse ektopisk ekspression, give passende tid til ekspression af det transficerede protein af interesse og til aflejring af ECM. I en emhætte, Forbered 20 mM ammoniumhydroxid i en egnet beholder ved at fortynde Stock Solution 1/14 med De-ioniseret H 2 O. Fjerne cellerne fra inkubatoren og forsigtigt fjerne dyrkningsmediet. Tilføj phosphatbufret saltvand (PBS) uden Ca2 + / Mg2 + ved forsigtigt at hælde mod væggene af skålen. Rock fadet to gange og fjern væsken med en plastik overførsel pipette. Gentag to gange mere. I en emhætte, vippe hver skål og fjern PBS fra trin 1.2 med en plastik overførsel pipette. Tilsæt 3ml ammoniumhydroxid pr 100-mm-skål og inkubere dem ved stuetemperatur i 5 min. Under 5-min inkubationsperiode, ryst forsigtigt skålen hver min for at sikre lysis af alle celler. Trin 1,4-1,7 vil også blive gennemført i emhætten. BEMÆRK: Alternativ fjernelse celle reagenser indbefatter 2 M eller 8 M urinstof, som inkuberes med cellerne i 10 min. Tilføj rigelige mængder deioniseret H2O til hver skål, mindst 20 ml pr 100 mm skål, med rocking. Bortskaffe ammoniumhydroxid-solubiliseret materiale-som er sammensat af ammoniumhydroxid, lyserede celler, og deioniseret H2O-ved opsugning med en overførsel pipette. Overfør dette affald opløsning i en beholder til flydende affald. Vask uopløselige ECM lag i rigelige deioniseret H 2 O fire gange mere for at sikre fuldstændig fjernelse af alle ammoniumhydroxid-opløst materiale. For undersøgelse af ECM ved immunfluorescens, løse ECM ved tilsætning af 2%paraformaldehyd (PFA; 3 ml pr 100 mm skål) ved stuetemperatur i 10 minutter. Advarsel: PFA er meget farlig i tilfælde af hud- eller øjenkontakt og svær overeksponering kan producere lungeskade, kvælning, bevidstløshed eller død. Det bør kun håndteres i en emhætte, og personlige værnemidler skal bæres. Vask hver fast prøve to gange med PBS, som i trin 1.2, og bortskaffe PFA opløsning i en egnet beholder flydende affald. Hvis det er nødvendigt, opbevare ECM prøver i PBS ved 4 ° C før forberede dem til fluorescens mikroskopi. 2. Tracking Aflejring af en ECM protein af konfokalmikroskopi Imaging af levende celler Tæl cellerne under et hæmocytometer. For COS-7-celler, plade 250.000 celler på en 60 mm cellekultur skål for transfektion. BEMÆRK: levende celler, skal cellerne transficeres med en vektor kodende for ECM proteinet af interesse, fusioneret i ramme med en genetisk kodet fluorescerernt tag. Dette er for at muliggøre identifikation af ECM proteinet af interesse under live-cell imaging. Efter en passende tid til proteinekspression (fx 16 timer) fjerne cellerne fra skålen med trypsin-EDTA-opløsning, tælle dem i et hæmocytometer, og pladernes ~ 150.000 celler på en 35-mm inddelte, glas-bund skål til billeddannelse. Tillad 2 timer for at cellerne kan vedhæfte og begynde ECM deposition (tidsperioden vil afhænge af celletypen og skal etableres empirisk). BEMÆRK: Brug et cellemedium, der ikke indeholder phenolrødt, da dette kan give et rødligt skær, der påvirker billedkvaliteten. I ovennævnte tidsrum på 2 timer, nedsat et konfokalt mikroskop med en 37 ° C inkubator kammer og et CO 2 forsyning. Lad temperaturen i kammeret og i skålen for at stabilisere til 37 ° C før billeddannelse; dette kan tage op til 1 time. Inkubér cellerne udpladet på 35 mm gitter skål med en fluorescerende cellemarkør i 30 min. Derefter vaskes cellerneto gange i phenol før billeddannelse rød-frit dyrkningsmedium. BEMÆRK: En cytoplasmatisk fluorescerende markør kan anvendes til at visualisere cellevolumener, eller en membran-inkorporering markør kan anvendes til at visualisere celle kanter. Brug af 20X objektiv og fase kontrast på en konfokal mikroskop, identificere en passende gitter firkant, der indeholder en række (> 3) for vedhængende, sunde celler. Bekræft ekspressionen af ​​målproteinet valg i cellerne i det valgte gitter firkantet hjælp af 63x eller 100X mål og de relevante bølgelængder under fluorescensmikroskopi. Opsæt fluorescens og fase-kontrast tid-lapse billeddannelse ved hjælp af en z-stak software. Indstil "starter" stakken for at være lige under ECM lag og "End" stakken for at være lige over cellen kroppen. Indstil z-trinstørrelse til 0,3 um og z-volumen til mellem 5 og 10 um dybde i alt, afhængig af celletype. Dette vil give mellem 15-30 z-sektioner pr tidspunkt. Capture fluorescens (for rødt fluorescerende protein (RFP), excitation = 555 nm og emission = 584 nm) og fase-kontrast billeder periodisk over en given periode. For eksempel bruger time-lapse software til at indstille tidsintervallet på 2 min og varigheden til 2 timer. Vælg knappen "start" for at begynde indfangning af z-sektion billeder over den definerede tidsperiode. Ved slutningen af ​​den periode, fjerne cellerne fra skålen, som beskrevet i trin 1,1-1,5, for at bekræfte lokaliseringen af ​​fluorescens-mærkede protein af interesse i ECM. Brug fase-kontrast imaging og 20X målsætning at flytte den relevante gitter firkantet. Skift til 63X objektiv og identificere ECM lag under fluorescens mikroskopi. Sammenlign dette billede til pre-udvinding billede 3. Steril Fremstilling af celleafledt ECM for Cell funktionelle assays Dyrk en population af celler (de "matrix producent-" celler) på dækglas og en anden befolkning ( "test" celler) i standard kultur i en 100 mm cellekultur parabol i mindst 24 timer. BEMÆRK: Disse kan være to forskellige vedhængende celletyper, og det eksperimentelle design kan omfatte transfektion af en eller begge cellepopulationer til at udtrykke en fluorescens-mærket ECM protein. I en laminær strømning, som anvendes til celledyrkning, fremstille sterile opløsninger af PBS uden Ca2 + / Mg2 +, 20 mM ammoniumhydroxid (se trin 1.3), og deioniseret H2O ved at føre hver gennem et sterilt 0,2 um filter i en passende steril beholder. Fastholdelse steril teknik, forsigtigt vaske de "matrix producent-" celler på dækglas tre gange med sterilt PBS (se trin 1.2). Fjern PBS ved aspiration med en steril pipette og bortskaffe det i en egnet beholder flydende affald. Tilsæt 20 mM steril ammoniumhydroxid (3 ml / 100 mm skål) og inkubere dem i 5 minutter med rocking med mellemrum. Tilføj rigelige mængdersterilt deioniseret H2O til "matrix producent" skål, mindst 20 ml pr 100 mm skål, med rokkende og hæld væk cellelysatet i en egnet affaldsbeholder. Gentag trin 3.5 fire flere gange for at sikre fuldstændig fjernelse af ammonium hydroxid-opløst materiale. BEMÆRK: ECM deponeret af de "matrix producent-" celler på dækglas giver derefter en steril ECM for funktionelle assays med eventuelle test celler af interesse. Inkuber testcellerne fra cellen stock skål med 1,5 ml trypsin-EDTA-opløsning pr 100 mm skål (0,05% vægt / volumen trypsin og 0,02% vægt / volumen EDTA i Hanks balancerede saltopløsning), indtil testcellerne frigøres fra skålen . Tilføj celle medium, centrifugeres testcellerne ved 400 xg i 5 min, og fjern supernatanten. Resuspender testcellerne i frisk, sterilt medium og tælle dem i et hæmocytometer. Plate et passende antal af disse test celler på den sterile, isoleret ECM på coverslips. Kultur dem i passende celle medium i 2-3 timer, eller i den tid, der er nødvendig for det eksperimentelle design. Om organiseringen af ​​actincytoskelettet, fastsætte testcellerne i 2% PFA og plette dem med fluoresceinisothiocyanat (FITC) -phalloidin (excitation = 490 nm og emission = 525 nm) for at visualisere F-actin og med 4 ', 6 -diamidino-2-phenylindol (DAPI; excitation = 358 nm og emission = 461 nm) for at visualisere kernerne 11. BEMÆRK: Sammenlign morfologi og actin organisation i testcellerne forgyldt på heterolog celle-afledt ECM med testceller belagt på deres egne ECM. 4. Isolering af ECM til SDS-PAGE, immunoblotanalyse, eller Proteomics Grow adhærente celler af interesse på 100 mm cellekultur retter (5 til 10 retter til proteomics eller 1-2 retter til immunoblotting) for 24-96 timer, afhængigt af den celletype, for at tillade sekretion og aflejring af ECM. Fjern celler som descrIBED i trin 1,1-1,5. Vippe hver plade i en vinkel til at dræne resterende H2O til bunden af skålen, og fjern forsigtigt eventuelle resterende H2O med en p200 pipette, indtil pladen er helt tørt. Parallelt hermed varme SDS-PAGE-prøvebuffer indeholdende 100 mM dithiothreitol (DTT) til 95 ° C i 2 min ved anvendelse af en varmeblok, og derefter tilføje det til pladen. 200 pi prøve buffer pr 100 mm plade er passende for prøver, der skal undersøges ved immunoblot. For at analysere ECM ved massespektrometri, opnå en mere koncentreret prøve ved opsamling af SDS-PAGE-prøvebuffer fra skålen (som beskrevet i trin 4.5 og 4.6, nedenfor), re-opvarmning til 95 ° C, og under anvendelse af samme portion tværs 2-3 yderligere plader. Brug en celle skraber til grundigt skrabe ECM fra fadet, der sikrer, at alle områder af fadet er blevet skrabet. Med celleskraber, indsamle prøven til den ene side af skålen og fjerne det med en 200uL pipettespids til et rør. Eventuelt resterende SDS-PAGE-prøvebuffer ekstrakt fra cellen skrabespids ind i røret for at minimere tabet af ECM-materiale. For en koncentreret prøve, genopvarme den samme SDS-PAGE-prøvebuffer alikvot til 95 ° C og genbruge det på tværs 2-3 yderligere plader. Løse ECM-proteiner ved SDS-PAGE 12, under anvendelse af enten 7% eller 4-7% gradient-polyacrylamidgeler. BEMÆRK: Det er bekvemt at anvende præ-farvede proteinmarkører. At forøge opløsningen af ​​high molekylvægt ECM-proteiner, forlænge gel køretid, således at 37 kDa molekylvægtmarkør løber tæt på bunden af ​​gelen og molekylvægtmarkører <37 kDa har afstrømning gelen. For proteomisk analyse af ECM-proteiner, plette gelen med et protein plet og tage et billede. Skær bands af interesse fra gelen, fordøje dem med trypsin, og analysere dem ved matrix-assisteret laser desorption / ionisering (MALDI) -massespektrometri <sup> 13. Alternativt, for en mere omfattende analyse af ECM ekstrakt og analysere hele prøven, slice gelen vognbane i sektioner, fordøje dem med trypsin, og udføre væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) 14. Alternativt, for immunoblotting 15, overføre proteiner fra SDS-PAGE gel på polyvinylidenfluorid (PVDF) membran ved 15 V i mindst 1 time 10 min (halvtør metode) for at sikre overførsel af high molekylvægt ECM-proteiner . Visualisere det totale protein overført til membranen med en Ponceau S plet. Efter trin 4.11, anvende antistoffer til påvisning og / eller lave en semikvantitativ analyse af individuelle ECM-proteiner 15. Blokere membranen med 2% (w / v) mælk i TBS-Tween 20 (blokeringspuffer) natten over ved 4 ° C. Fortynd specifikke antistoffer til ECM-proteiner i blokeringspuffer og inkuberes med membranen i 1,5 time ved stuetemperatur (antistof til fibronectin fortyndet 1/600 og antistof mod thrombospondin-1 fortyndet 1/150; Supplerende tabel 1). Teste kvaliteten af ​​ECM isolering ved re-probing den samme blot med antistoffer mod rigelige intracellulære proteiner, såsom actin eller tubulin (anti-actin fortyndet 1 / 10.000 og anti-tubulin fortyndet 1 / 5.000).

Representative Results

Fremgangsmåden beskrevet i protokoltrin 1,1-1,5 handlinger til fjernelse af celler og efterlade den celleafledt ECM. Protokollen blev udført på COS-7-celler dyrkes i 96 timer på dækglas, og celleafledt ECM blev analyseret ved fluorescensmikroskopi. Den ammoniumhydroxid behandling fjernede cellerne effektivt, som er oprettet ved tabet af cellekerner og aktincytoskelet ifølge DAPI og phalloidin farvning (figur 1). Ekstraktionen af ​​celler med 2 M urinstof var ikke så effektiv som ammoniumhydroxid; blev påvist spor af DAPI og phalloidin-farvning efter behandling. 8 M urinstof havde en lignende virkning som ammoniumhydroxid (figur 1). Dernæst blev celleafledt ECM visualiseret før og efter ammoniumhydroxid behandling (trin 2,1-2,11). COS-7-celler blev transficeret med et monomert rødt fluorescerende protein (mRFP) -mærket thrombospondin-1 C-terminal trimer, (mRFPovTSP1C) 11 og dyrket på en 35 mm skål med en gitret glas base. To timer efter udpladning en egnet gitter firkantet, der indeholdt multiple raske celler, der udtrykker mRFPovTSP1C blev visualiseret under et konfokalt mikroskop. En reference fase kontrast billede blev taget i dette område, og derefter fluorescens-time-lapse billeddannelse blev udført hver 1 min til 2 h (figur 2A). Celler blev derefter fjernet under anvendelse af ammoniumhydroxid, og det samme gitter firkantet på skålen blev flyttet under fasekontrast og derefter igen analyseret ved fluorescensmikroskopi. Cellerne var ikke længere til stede i gitter firkantet, men mRFPovTSP1C holdt sig inden for ECM, opdaget ved fluorescens mikroskopi som karakteristisk puncta (figur 2A). Enhver mRFPovTSP1C deponeret i ECM før cellefjernelse blev identificeret ved sammenligning af fluorescens-mønster før og efter fjernelse af celler. Den fluorescerende puncta identificeret i begge billeder (Figure 2A, eksempel pile) er udledt at være forbundet med ECM. Ammoniumhydroxid behandling blev derefter anvendt til at isolere nativ ECM fra dyrkede, adhærerende celler. Humane dermale fibroblaster (HDF) blev dyrket på dækglas i 96 timer. Celler blev fjernet under anvendelse af ammoniumhydroxid, og ECM blev probet med et anti-kollagen I antistof, som viste en karakteristisk fibrillært og meshwork farvningsmønster 16 (figur 2B). Fibronectin mønsterdannelse blev undersøgt omkring faste, ikke-permeabiliserede rotte chondrosarcoma celler (RCS) og inden for ECM efter fjernelse af RCS-celler (figur 2C). Den ammoniumhydroxid isolering af ECM blev også udført under sterile forhold, så "test" celler kunne være re-belagte på ECM for fænotypiske eller funktionelle studier. For eksempel "test" COS-7-celler blev udpladet i 2 timer på steril ECM produceret af RCS-celler, og thøne de blev fastsat, permeabiliseret, og analyseret for F-actin organisation ved FITC-phalloidin-farvning, i sammenligning med COS-7 celler, der producerer deres egen ECM (trin 3,1-3,9) (figur 3). På en større skala, blev den anvendte metode til at isolere ECM til biokemiske procedurer. For eksempel blev RCS-celler dyrket på to 100 mm cellekulturskåle i 7 dage, og procedurerne i trin 4.1-4.7 blev fulgt. Proteiner i celleafledt ECM blev opsamlet ved skrabning dem i varm SDS-PAGE-prøvebuffer og blev separeret ved SDS-PAGE på en 7% polyacrylamidgel under reducerende betingelser. Gelen blev farvet for protein, og de fire store bånd blev hver isoleret og analyseret ved massespektrometri (figur 4A). Et antal ECM-proteiner, herunder fibronektin, thrombospondin 1 (TSP1), thrombospondin 5 / oligomert bruskmatrixprotein (TSP5 / COMP), og matrilin-1 blev identificeret (figur 4B). Alternativt kan mindre målestok præparater af ECM evalueres ved immunoblots. F.eks celleafledt ECM fra COS-7-celler ektopisk udtrykker mRFPovTSP1C blev separeret ved SDS-PAGE, overført til en PVDF-membran og probet for RFP med et anti-RFP-antistof (figur 4C). Denne teknik er følsom nok til at detektere forskelle i deposition mellem en nativ trimer af TSP1 (mRFPovTSP1C) og et manipuleret pentamer af TSP1 C-terminale region (mRFP-TSP-5-1C) 17 (figur 4C). For at undersøge endogen ECM af HDF blev tilstedeværelsen af ​​specifikke proteiner i cellelysat eller den isolerede ECM undersøgt ved immunoblotting. Den karakteristiske ECM-proteiner fibronektin og thrombospondin-1 blev påvist i ECM, mens de rigelige intracellulære proteiner α-tubulin og β-actin var fraværende fra den isolerede ECM (figur 4D). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-side = "1"> Figur 1: Sammenligning af metoder til Cell Removal. COS-7-celler blev dyrket ved høj tæthed i 96 timer på dækglas, faste i 2% PFA, og permeabiliseret i 0,5% Triton X100, eller blev behandlet som angivet for celle fjernelse. Dækglas blev derefter farvet med FITC-phalloidin at visualisere F-actin og DAPI at visualisere cellekerner. Scale bar = 25 um. Dette tal er modificeret fra en original publikation i Journal of Cell Science 11. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2: Identifikation af ECM-proteiner i Isoleret ECM. (A) Fase kontrast og fluorescens billeder afCOS-7-celler, der udtrykker mRFPovTSP1C og dyrket på en 35 mm skål med en glas-bund, gridded base for 2 timer. Billeder vises før og efter fjernelse af cellerne ved ammoniumhydroxid. Kanten af ​​nettet brevet fremgår af fase-kontrast billeder med en stiplet linje. Hvide pile angiver eksempler på fluorescerende puncta der var til stede før og efter celle fjernelse. (B) Påvisning af kollagen I i HDF ECM ved indirekte immunofluorescens. HDF blev dyrket i 96 timer og fjernes med ammoniumhydroxid og ECM blev farvet for humant fibrillært collagen I. ECM blev også farvet med FITC-konjugeret anti-kanin sekundært antistof alene. (C) Lokalisering af fibronectin omkring RCS-celler eller inden isolerede RCS ECM, som påvist ved indirekte immunfluorescens. RCS-celler blev dyrket i 48 timer, faste i 2% PFA, og farvet for fibronectin og med DAPI. Ved parallelle skåle, blev celler fjernet med 20 mM ammoniumhydroxid og ECM blev farvet for fibronectin og med DAPI. Celler blev også farvet med FITC-konjugeret anti-muse-IgG-antistof alene. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 3: Anvendelse af sterilt ECM for Funktionelle studier. RCS "matrix producent" celler blev dyrket i 48 timer på dækglas og derefter behandlet med 20 mM ammoniumhydroxid under sterile betingelser for at fjerne cellerne. COS-7 "Test" celler blev udpladet på dækglas med eller uden isolerede RCS ECM i 2 timer, fikseret i 2% PFA, permeabiliseret i 0,5% Triton X100 og farvet med FITC-phalloidin at visualisere F-actin og DAPI at visualisere cellekerner . COS-7 celler belagte på RCS ECM spredt mere udførligt og dannede store Microfilament bundter (eksempel pile) og kant pibekraveles. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 4: Identificering af proteiner fra isolerede ECM ved SDS-PAGE, massespektrometri eller immunblotting. (A) RCS-celler blev dyrket i 7 dage og fjernet med 20 mM ammoniumhydroxid; ECM blev skrabet op i varm SDS-PAGE-prøvebuffer indeholdende 100 mM DTT. Fremstillingen ECM blev separeret ved SDS-PAGE på en 7% polyacrylamidgel under reducerende betingelser. Fire betydende bånd (pile 1-4), blev identificeret ved proteinfarvning. (B) Proteiner fra RCS ECM bands 1-4 blev identificeret ved MALDI-massespektrometri. (C) COS-7-celler der udtrykker enten mRFPovTSP1C (trimer) eller mRFP-TSP-5-1C (pentamer) blev dyrket i 48h og fjernet med 20 mM ammoniumhydroxid, og var ECM isoleret i varm SDS-PAGE-prøvebuffer indeholdende 100 mM DTT. Fremstillingen ECM blev separeret ved SDS-PAGE på en 7% polyacrylamidgel under reducerende betingelser, overført til en PVDF-membran og probet med et anti-RFP-antistof. Dette panel er modificeret fra en original offentliggørelsen i Bioscience Reports 17. (D) HDF blev dyrket i 96 timer og derefter behandlet med enten 2% deoxycholsyre i PBS (cellelysat) eller med 20 mM ammoniumhydroxid for at fjerne celler. ECM blev skrabet over i varm SDS-PAGE-prøvebuffer. De to fraktioner blev separeret ved SDS-PAGE på en 10% polyacrylamidgel under reducerende betingelser, overført til en PVDF-membran og probet med antistoffer, som angivet. I hvert panel, er positionerne af molekylvægtmarkører angivet i kDa. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Kritiske trin i protokollen

Metoden har nogle kritiske trin, der skal følges for at sikre en vellykket isolering og analyse af ECM. For eksempel er ammoniumhydroxid anvendes til at fjerne cellerne og at isolere ECM til analyse. Selvom ammoniumhydroxid er stabil i vandige opløsninger i mørke og kan opbevares ved stuetemperatur, flasker skal være tæt på ny forseglet mellem hver brug. Fordi gassen kan fordampe fra opløsningen, hvorved fusionen, anbefaler vi startede en frisk flaske hver 6-8 uger. Desuden bør arbejdsopløsningen fremstilles frisk for hvert forsøg. Det er også vigtigt, at cellerne er fuldt fjernes med rigelige vaske i deioniseret vand. Hvis disse trin ikke er udført tilstrækkeligt, kan cellulært materiale forblive på fad og forurene downstream analyser. Hvis cellerne er blevet dyrket i 10 dage eller længere, kan være behov for yderligere vand vaske. Det er vigtigt at note at det isolerede ECM lag er typisk meget tynd i forhold til cellerne ^11, så pleje er nødvendig, når identificerer ECM under billedbehandling. Til effektiv ekstraktion af den isolerede ECM i SDS-PAGE-prøvebuffer, er det vigtigt, at prøven buffer indeholder et reduktionsmiddel. For den mest effektive fjernelse af ECM, skal der anvendes kogende-hot prøve buffer. For forsøg, hvor ECM prøver vil blive løst ved SDS-PAGE-elektroforese til proteinfarvning eller proteomics, er det afgørende at opnå en koncentreret prøve ved at skrabe flere plader-værdi af ECM i den samme portion af prøvepuffer.

Ændringer og fejlfinding

Produktion og sekretion af ECM-proteiner kan variere betydeligt mellem celletyper, så tidsperioder for sekretion og aflejring af ECM bør bestemmes de novo for hver celletype. Det er også vigtigt at være opmærksom på, at ECM sammensætning vil ændre sig dynamisk i forhold to celletæthed og tid i kultur ^18. bør tages Denne faktor i betragtning ved udformningen eksperimenter. Det er klart, at valget af en celletype til denne metode er vigtig, især når ekstraktion ECM til analyse ved massespektrometri, hvilket kan kræve en væsentlig mængde af den samlede ECM protein.

Begrænsninger af teknikken

Celler der udskiller meget lave niveauer af ECM-proteiner vil være mere udfordrende til brug med denne fremgangsmåde. Ikke-adhærente celler, 3D cellekulturer eller celleinvasion assays er uegnede til stede ved ECM isolering ved denne metode. Fremgangsmåden er mest egnet til anvendelse med standard "2-dimensionale" cellekulturer. Fordi ammoniumhydroxid ekstraktion fjerner cellerne fuldstændigt, ECM forbundet med de øvre sider af celler og udskilles, men ikke-tværbundet, er ECM-proteiner også fjernet, forlader på skålen et tyndt lag af samlet ECM nedefra og op for foden af cellerne ^11,17 </sup>. Det er kompliceret at måle, hvor stor ECM frigives af ammoniumhydroxid ekstraktion, fordi det frigivne materiale indeholder også ECM-proteiner, der er intracellulær enten forud for sekretion eller efter optagelse fra celleoverfladen.

Betydningen af ​​Teknik med Respekt for eksisterende / Alternative Metoder

Evnen til at udføre en bred vifte af eksperimenter med isolerede ECM er vigtig i forbindelse med cellebiologi og væv fysiologi, og det har også konsekvenser for områderne vævsregenerering og vævsmanipulering. Metoden har fordele i forhold til geler dannet ud fra oprensede kollagener eller andre oprensede ECM-proteiner ved, at cellerne samle komplekse ECM strukturer på deres native størrelse, med indfødte tværbindende mekanismer og med individuelle ECM-proteiner til stede i forhold egnede til celletypen oprindelseslandet. For eksempel proteomik undersøgelse af RCS ECM demonstrerede rigelige matrilins og COMP / TSP5, som forventet foren bruskagtig ECM ^19,20 (figur 4). Generelt er analysen af ​​celleafledt ECM hæmmet af sin natur som en omfattende, multi-protein netværk, der resulterer i kovalent tværbinding og uopløseligheden af ​​mange ECM-proteiner, og også af den potentielle forurening af ECM-ekstrakter med intracellulære proteiner. En multi-trins procedure designet til at isolere ECM fraktion fra væv til proteomanalyse gav 8% af ECM-proteiner i det samlede sæt af proteiner identificeret ^21. Men peptider fra ECM-proteiner var 73% af de samlede peptider identificeret. Denne metode til isolering og analyse af celleafledt ECM hurtigt og pålideligt fjerner cellemateriale samtidig bevare ECM-proteiner. Denne metode kan anvendes til en række celletyper og efterfølgende anvendelser og letter analysen af ​​ECM biologi og celle-ECM-vekselvirkninger i cellekultur. Vores protokoller detaljer, hvordan metoden kan anvendes på forskellige skalaer til at løse en bred vifte af experimental spørgsmål med hensyn til ECM organisation, dynamik, eller sammensætning, og de funktionelle effekter af isolerede ECM på celler.

Fremtidige Programmer eller vejvisning efter Mastering Denne teknik

Et blik på fremtiden, kunne metoden tilpasses til brug med 3D cellekulturer; dette ville udvide sin fysiologiske relevans. Decellulariseret indfødte væv har et stort potentiale som et stillads for regenerering af tabt eller beskadiget væv og som et alternativ til transplantation, såsom efter hjertesvigt ^22. Det har potentiale til at overvinde problemerne med donor tilgængelighed og immunorejection. Fremtidige anvendelser af den er beskrevet i denne rapport metode kunne undersøge dens anvendelse med 3D cellekulturer eller væv decellularization, hvilket yderligere vil øge omfanget af denne tilgang.

Materials

Antibody to COL1A1	Novus	NB600-408	Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I.  IF:  1/200
Antibody to fibronectin	Sigma	F3648	Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 hr. IF: 1/200
Antibody to thrombospondin 1	ThermoFisher	MA5-13398	Mouse monoclonal clone A6.1.  WB: 1/150 for 1.5 hr
Antibody to RFP	Abcam	ab62341	Rabbit polyclonal. WB: 1/2000 for 2 hr
Antibody to β-actin	Sigma	A1978	Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10000 for 1.5 hr
Antibody to α-tubulin	Sigma	T9026	Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5000 for 1.5 hr
Cell Tracker Green	ThermoFisher	C2925	Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin	Sigma	P-5282	Stock = 50mg/ml in DMSO.1/50 for 45 min
FITC-conjugated goat anti-mouse IgG	Sigma	F8771	IF: 1/50 for 1 hr
FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG	SIgma	F7512	IF: 1/50 for 1 hr
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-80010	WB: 1/50000 for 1 hr
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG	LI-COR	926-80011	WB: 1/100000 for 1 hr
Vectorshield mounting medium with DAPI	Vector	H-1200	Store at 4 C in the dark
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D6429	Warm before use
Fibroblast growth medium	PromoCell	C-23010	Warm before use, supplement with 50 µg / mL ascorbic acid
Phenol red-free DMEM	ThermoFisher	21063-029	Warm before use
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm before use
Gridded glass-bottomed dish	MatTek	P35G-2-14-C-GRID
NH4OH, 28% – 30%  solution	Sigma	221228	Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped.
Paraformaldehyde, 16 % solution	Alfa Aesar	43368	Dilute to 2 % (v/v) in PBS
Deoxycholic acid	Sigma	D2510	Use at 2 % (v/v) final concentration
Triton X-100	Sigma	T8787	Dilute to 0.5 % (v/v) final concentration
GelCode Blue stain reagent	ThermoFisher	24590	Protein stain for SDS-PAGE gels
Precision Plus protein standards	Biorad	161-0374	Protein standards for SDS-PAGE gels
Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell	Biorad	1703940	Efficient transfer of high molecular weight proteins
PVDF transfer membrane	Millipore	ISEQ00010	Immobilon-PSQ
Ponceau S stain	Sigma	P7170	Reversible protein stain for PVDF membrane
WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate	LI-COR	926-80200
High performance chemiluminescence film	GE Healthcare	28906837
Sterile filtration unit, MILLEX-GV	Millipore	ML481051
SP8 AOBS confocal laser scanning microscope	Leica		Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services)
Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot