The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.
The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.
Under de senaste decennierna har den extracellulära matrisen (ECM) bli erkänd som ett mångsidigt, dynamisk och komplex miljö som är involverad i flera cell fysiologiska och patologiska processer. På vävnadsnivå, påverkar ECM cellsignalering, rörlighet, differentiering, angiogenes, stamcellsbiologi, tumörbildning, fibros, etc. 1,2. Studiet av ECM organisation och ECM beroende processer har sålunda breda implikationer för cellbiologi och vävnadsfysiologi. För att nå en mekanistisk förståelse av ECM sammansättning, organisation, och funktionella egenskaper, metoder för noggrann isolering av ECM erfordras. Medan den tidigaste identifiering av ECM-proteiner som åberopats isolering från vävnader 3, har framställningen av ECM från odlade celler nu blivit vanligare.
Isoleringen och analys av cell härledd ECM är komplicerat av två skäl. För det första, närvaron av celler ochir rikliga intracellulära proteiner kan göra det svårt att isolera ECM som en diskret extracellulär struktur. En del ECM-proteiner har roller inuti cellen liksom i ECM 4; Därför är det effektivt avlägsnande av intracellulära proteiner från cell-derived ECM avgörande om studier av proteiner inom ECM är inte att förväxla med sina roller inne i cellen. För det andra, är cellhärledda ECM består av många stora, oligomera proteiner, som ofta är kovalent tvärbunden på ECM montering och därför är olösliga i vanliga rengöringsmedel. Dessa egenskaper kan komplicera utvinning och ytterligare analys av ECM. Att hantera dessa frågor, är en metod som krävs som möjliggör effektiv separation av ECM-proteiner från cellulära komponenter.
Flera metoder har beskrivits i litteraturen för isolering av ECM från antingen cellkultur eller vävnadsextrakt. Många av dessa metoder syftar till utvinning av den rikliga ECM protein, kollagen, från vävnader och innefattar användningen av neutrala salter 3, sura betingelser 5,6, eller pepsin 7. Isolering av total-ECM från vävnadsextrakt innebär ofta decellularisering av vävnaden före isoleringen av ECM. Till exempel har en sekventiell extraktionsmetod beskrivits som isolerar ECM från human hjärtvävnad 8. Först var löst bundna ECM-proteiner extraherades med 0,5 M NaCl före natriumdodecylsulfat (SDS) användes för att avlägsna cellerna. Slutligen, var de återstående ECM-proteiner utvinns med hjälp av 4 M guanidin 8. ECM kan också lösas från decellulariserade prover med användning av 8 M urea 9. Andra tekniker använder detergenter, såsom deoxicholsyra 10, för att extrahera både celler och ECM före separation olösliga ECM-proteiner från den lösliga cellysatet genom centrifugering.
Metoden för isolering och analys av cell härledd ECM beskrivs i denna rapport ger en reproskapas metod för att avlägsna cellmaterial, vilket lämnar cellhärledda ECM som kan analyseras genom in situ-immunofluorescens eller extraheras för vidare biokemisk analys. Denna metod kan anpassas för någon adherent celltyp och kan skalas upp för nedströms förfaranden, såsom immunoblotting eller masspektrometri, eller för användning av den isolerade ECM i funktionella studier. Metoden kan även användas tillsammans med konfokal mikroskopi av levande celler för att spåra ECM avsättning av ett märkt protein av intresse i realtid. Detta uppnås genom användning av en förnätade, glasbottnad skål. Sammantaget ger det tillvägagångssätt en exakt isolering av cell härledd ECM och även möjligheter att identifiera och övervaka avsättningen och dynamiken i enskilda ECM-proteiner.
Kritiska steg i protokollet
Metoden har några viktiga steg som måste följas för att säkerställa en framgångsrik isolering och analys av ECM. Till exempel är ammoniumhydroxid som används för att avlägsna cellerna och för att isolera ECM för analys. Även om ammoniumhydroxid är stabilt i vattenlösningar i mörker och kan lagras vid rumstemperatur, flaskor måste vara tätt återförseglas mellan varje användning. Eftersom gasen kan avdunsta från lösningen, vilket minskar koncentrationen, vi rekommenderar att starta en ny flaska var 6-8 veckor. Dessutom bör den verksamma lösningen göras färskt för varje experiment. Det är också väsentligt att cellerna är helt avlägsnas med kopiösa tvättar i avjonat vatten. Om dessa åtgärder inte utförs på lämpligt sätt, kan cellmaterial kvar på skålen och förorena analyser nedströms. Om celler har odlats i 10 dagar eller längre, kan ytterligare vattentvättningar behövas. Det är viktigt att nOTE som den isolerade ECM skiktet är typiskt mycket tunn i jämförelse med cellerna 11, så vård behövs vid identifiering ECM under avbildning. För effektiv extraktion av den isolerade ECM i SDS-PAGE-provbuffert, är det väsentligt att provbufferten innehåller ett reduktionsmedel. För det mest effektiva borttagandet av ECM, måste kokning-hot-provbuffert användas. För experiment där ECM prover kommer att lösas genom SDS-PAGE-elektrofores för proteinfärgning eller proteomik, är det viktigt att uppnå en koncentrerad prov genom att skrapa flera plåtar-värde av ECM i samma portion av provbuffert.
Ändringar och felsökning
Produktion och sekretion av ECM-proteiner kan variera avsevärt mellan celltyper, så tidsperioder för sekretion och deponering av ECM bör bestämmas de novo för varje celltyp. Det är också viktigt att vara medveten om att ECM sammansättning kommer att förändras dynamiskt i förhållande to celltäthet och tid i odling 18. Denna faktor bör beaktas vid utformningen av experiment. Det är uppenbart att valet av en celltyp för denna metod viktigt, särskilt vid extrahering ECM för analys med masspektrometri, vilket kan kräva en avsevärd mängd av den totala ECM protein.
Begränsningar av tekniken
Celler som utsöndrar mycket låga nivåer av ECM-proteiner kommer att vara mer utmanande för användning med denna metod. Icke vidhäftande celler, 3D cellkulturer eller cellinvasionsanalyser är olämpliga för närvarande för ECM isolering genom denna metod. Metoden är mest lämpad för användning med standard "två-dimensionella" cellkulturer. Eftersom ammoniumhydroxid extraktion avlägsnar cellerna helt, ECM som är förknippade med de övre sidorna av cellerna och som utsöndras, men icke-tvärbunden, är ECM-proteiner också tas bort, varvid på skålen ett tunt skikt av sammansatt ECM underifrån och omkring baserna av cellerna 11,17 </sup>. Det är komplicerat att mäta hur mycket ECM frigörs av ammoniumhydroxid extraktion, eftersom det frigjorda materialet inkluderar även ECM-proteiner som är intracellulär antingen före utsöndring eller efter upptagning från cellytan.
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder
Förmågan att genomföra en mängd olika experiment med isolerade ECM är viktigt i samband med cellbiologi och vävnadsfysiologi, och den har också implikationer för områdena vävnadsregenerering och vävnadsteknik. Metoden har fördelar jämfört med geler bildade av renade kollagener eller andra renat ECM-proteiner i att cellerna sammankoppla komplexa ECM strukturer på sin nativa storlek, med nativa tvärbindningsmekanismer och med enskilda ECM proteiner närvarande i förhållanden som är lämpliga för celltypen av ursprung. Till exempel, den proteomic studien av RCS ECM visade riklig matrilins och COMP / TSP5, som förväntat fören brosk ECM 19,20 (Figur 4). I allmänhet är en analys av cell härledd ECM hindras av sin natur en omfattande, multi-proteinnätverk som resulterar i kovalent tvärbindning och olöslighet av många ECM-proteiner, och även av den potentiella förorening av ECM extrakt med intracellulära proteiner. Ett flerstegsförfarande utformat för att isolera ECM fraktionen från vävnader för proteomik analys gav 8% av ECM-proteiner i den totala uppsättningen av proteiner som identifierats 21. Men peptider från ECM-proteiner var 73% av det totala antalet peptider som identifierats. Denna metod för isolering och analys av cell härledd ECM snabbt och tillförlitligt avlägsnar cellulärt material samtidigt som de behåller ECM-proteiner. Denna metod kan användas för en rad olika celltyper och efterföljande tillämpningar och underlättar analysen av ECM biologi och cell-ECM-interaktioner i cellkultur. Våra protokoll detalj hur metoden kan tillämpas i olika skalor för att hantera ett brett spektrum av experimental frågor när det gäller ECM organisation, dynamik, eller komposition, och de funktionella effekterna av isolerade ECM på celler.
Framtida tillämpningar eller riktningar efter behärska denna teknik
Om man ser framåt, kan metoden anpassas för användning med 3D-cellkulturer; Detta skulle utöka sin fysiologiska relevans. Decellulariserade naturliga vävnaden har stor potential som en byggnadsställning för regenerering av förlorad eller skadad vävnad och som ett alternativ till transplantation, till exempel efter hjärtsvikt 22. Den har potential att övervinna problemen med donator tillgänglighet och immunorejection. Framtida tillämpningar av den metod som beskrivs i denna rapport kan undersöka dess användning med 3D-cellkulturer eller vävnad decellularisering, vilket ytterligare skulle öka omfattningen av denna strategi.
The authors have nothing to disclose.
Vi är mycket tacksamma till Dr Belinda Willard, proteomik och metabolomik Laboratory, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, för att genomföra proteomik analys av RCS ECM. Vi erkänner ekonomiskt stöd från theMedical Research Council i Storbritannien, bevilja nummer K018043 till JCA.
Antibody to COL1A1 | Novus | NB600-408 | Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I. IF: 1/200 |
Antibody to fibronectin | Sigma | F3648 | Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 hr. IF: 1/200 |
Antibody to thrombospondin 1 | ThermoFisher | MA5-13398 | Mouse monoclonal clone A6.1. WB: 1/150 for 1.5 hr |
Antibody to RFP | Abcam | ab62341 | Rabbit polyclonal. WB: 1/2000 for 2 hr |
Antibody to β-actin | Sigma | A1978 | Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10000 for 1.5 hr |
Antibody to α-tubulin | Sigma | T9026 | Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5000 for 1.5 hr |
Cell Tracker Green | ThermoFisher | C2925 | Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min |
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin | Sigma | P-5282 | Stock = 50mg/ml in DMSO.1/50 for 45 min |
FITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Sigma | F8771 | IF: 1/50 for 1 hr |
FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG | SIgma | F7512 | IF: 1/50 for 1 hr |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-80010 | WB: 1/50000 for 1 hr |
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | LI-COR | 926-80011 | WB: 1/100000 for 1 hr |
Vectorshield mounting medium with DAPI | Vector | H-1200 | Store at 4 C in the dark |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | Warm before use |
Fibroblast growth medium | PromoCell | C-23010 | Warm before use, supplement with 50 µg / mL ascorbic acid |
Phenol red-free DMEM | ThermoFisher | 21063-029 | Warm before use |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm before use |
Gridded glass-bottomed dish | MatTek | P35G-2-14-C-GRID | |
NH4OH, 28% – 30% solution | Sigma | 221228 | Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped. |
Paraformaldehyde, 16 % solution | Alfa Aesar | 43368 | Dilute to 2 % (v/v) in PBS |
Deoxycholic acid | Sigma | D2510 | Use at 2 % (v/v) final concentration |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Dilute to 0.5 % (v/v) final concentration |
GelCode Blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | Protein stain for SDS-PAGE gels |
Precision Plus protein standards | Biorad | 161-0374 | Protein standards for SDS-PAGE gels |
Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell | Biorad | 1703940 | Efficient transfer of high molecular weight proteins |
PVDF transfer membrane | Millipore | ISEQ00010 | Immobilon-PSQ |
Ponceau S stain | Sigma | P7170 | Reversible protein stain for PVDF membrane |
WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate | LI-COR | 926-80200 | |
High performance chemiluminescence film | GE Healthcare | 28906837 | |
Sterile filtration unit, MILLEX-GV | Millipore | ML481051 | |
SP8 AOBS confocal laser scanning microscope | Leica | Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services) | |
Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot |