We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.
सबसे स्तनधारियों में, मध्य कान में श्रवण ossicles, कान में की हड्डी, इन्कस और स्टेपीज़ सहित, छोटी हड्डियों कर रहे हैं। चूहों में, एक बोनी संरचना बुलाया श्रवण बुल्ला ossicles घरों, जबकि श्रवण कैप्सूल भीतरी कान, अर्थात् कोक्लीअ और semicircular नहरों encloses। Murine ossicles ओटोलर्यनोलोजी के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए महान ब्याज की सुनवाई और इस प्रकार के लिए आवश्यक हैं, लेकिन उनके चयापचय, विकास और विकास के अन्य क्षेत्रों के लिए प्रासंगिक हैं। बदल हड्डी चयापचय वयस्क चूहों में सुनवाई समारोह को प्रभावित कर सकते हैं, और विभिन्न जीन की कमी चूहों गर्भाशय में श्रवण ossicles के morphogenesis में परिवर्तन दिखा। हालांकि murine श्रवण ossicles छोटे हैं, उनके हेरफेर संभव है, तो अपने संरचनात्मक अभिविन्यास और 3 डी संरचना को समझता है। यहाँ, हम श्रवण बुल्ला और प्रसव के बाद चूहों के कैप्सूल काटना और फिर कैसे बुल्ला के हिस्से को हटाने के द्वारा अलग-अलग ossicles को अलग वर्णन है। हम यह भी चर्चा है कि कैसे उन्हें करने के लिएबिस्तर बुल्ला और विभिन्न झुकाव में कैप्सूल आयल या फ्रोजन वर्गों कान में की हड्डी की, अनुदैर्ध्य क्षैतिज, या ललाट वर्गों की तैयारी के लिए उपयुक्त उत्पन्न करते हैं। अंत में, हम माउस और मानव श्रवण ossicles के बीच शारीरिक मतभेद की गणना करें। इन विधियों श्रवण ossicles की, रोग विकास और विकासवादी पहलुओं और चूहों में मध्य कान का विश्लेषण करने में उपयोगी होगा।
मध्य कान के तीन श्रवण ossicles, अर्थात् कान में की हड्डी, इन्कस, और स्टेपीज़, एक स्तनधारी-विशिष्ट श्रवण श्रृंखला है कि भीतरी कान के लिए कान की झिल्ली, या कोक्लीअ 1,2 से ध्वनि पहुंचाता के रूप में। समारोह सुनकर चूहों में श्रवण brainstem रिस्पांस (ABR) थ्रेसहोल्ड 3-6, और कान की झिल्ली लेजर डॉपलर Vibrometry (LDV) 7 का उपयोग कर नजर रखी जा सकती पीछे कान में की हड्डी के कंपन को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। ABR, LDV, और विरूपण उत्पाद Otoacoustic उत्सर्जन (DPOAE) माप के संयोजन से, प्रवाहकीय सुनवाई हानि sensorineural हानि 8 से भेदभाव किया जा सकता है।
कान की स्थिति के पशु मॉडल की जरूरत है, सुनने और सभी उम्र के रोगियों की भलाई के लिए कान स्वास्थ्य के महत्व को देखते हुए। उदाहरण के लिए, ओटिटिस मीडिया एक बेहद आम कान मानव शिशुओं और बच्चों, और गंभीर, तीव्र ओटिटिस मीडिया में देखा संक्रमण है और इसकी जटिलताओं कब्जा करता है, तो हो सकता हैtion उचित antimicrobials 9 के साथ इलाज नहीं है। ओटिटिस मीडिया के माउस मॉडल रोगजनन को समझने में और उपचार 10,11 विकसित करने में उपयोगी साबित हो सकता है।
Murine ossicles है, जो (कान में की हड्डी की goniale भाग के लिए छोड़कर) endochondral हड्डी बन जाना 12,13 से बनते हैं, हड्डी चयापचय और morphogenesis के अध्ययन के लिए प्रासंगिक हैं। पहला, उनके छोटे आकार के एक अक्षुण्ण periosteum एक्स-रे या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 14 उपयोग करने के साथ हड्डियों के उच्च संकल्प विश्लेषण की अनुमति देता है। दूसरा, इस तरह के अत्यधिक या कमी हड्डी अवशोषण, या अस्थि कोशिकाओं के बीच 15 बिगड़ा बातचीत के रूप में न्यायपालिका हड्डी चयापचय, नुकसान 3,4,7 की सुनवाई के लिए एक संभावित योगदानकर्ता के रूप में विश्लेषण किया जा सकता है। तीसरा, असामान्य हड्डी morphogenesis ऐसे Hoxa2 16-19, 20-22 Msx1, Prrx1 23, Goosecoid कमी जानवरों के रूप में कई जीन की कमी चूहों, में सूचना दी है(GSC) 24,25, 13 Bapx1, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27, नोगिन (खूंटी), 28, 29 Fgfr1, थायराइड हार्मोन रिसेप्टर्स (Thra, Thrb) 5, Bcl2 30 और दूसरों को 1,31, या चूहों में overexpressing Hoxa2 32। अंत में, अपने छोटे आकार के बावजूद, संरचनाओं इस तरह की मांसपेशियों और जोड़ों 33 34,35 के रूप में ossicles के साथ जुड़े पहुंच रहे हैं।
माउस ossicles मानव ossicles से छोटे हैं, लेकिन यह उल्लेखनीय है कि माउस मध्य कान अपने मानव समकक्ष का एक लघु संस्करण नहीं है। उदाहरण के लिए, चूहों में, stapedial धमनी, जो स्टेपीज़ की अंगूठी के माध्यम से गुजरता है, जीवन भर 36, बनी रहती है, जबकि मानव में, भ्रूण stapedial धमनी गर्भ के दौरान गायब हो जाता है। इसके अलावा, माउस कान में की हड्डी की आकृति विज्ञान वीं के उस से अलगई मानव हड्डी (चित्रा 6 देखें)। चूहों में, श्रवण (मध्य कर्ण) बुल्ला, हवा से भरा मध्य कान गुहा encloses जबकि मानव में, कर्णमूल हवा लौकिक हड्डी में घरनदार हड्डी से बना कोशिकाओं को एक बुल्ला 37 से ossicles घरों बल्कि। दोनों प्रजातियों में, श्रवण कैप्सूल (कान का कैप्सूल, बोनी भूलभुलैया) कोक्लीअ और भीतरी कान की semicircular नहरों encloses। मध्य कान की तुलनात्मक और विकासवादी जीव विज्ञान में बड़े पैमाने पर 38-40 समीक्षा की गई है।
पहले नीचे प्रदान प्रोटोकॉल का वर्णन श्रवण बुल्ला और कैप्सूल है, जो मध्य कान और भीतरी कान की मुख्य रूप से मिलकर काटना करने के लिए कैसे, क्रमशः। इस प्रोटोकॉल भी दर्शाता है कि कान में की हड्डी, इन्कस और श्रवण बुल्ला से स्टेपीज़ को अलग-थलग करने के लिए कैसे। अंत में, यह श्रवण ossicles के ऊतक सेक्शनिंग के लिए तैयार करने में एम्बेड करने के लिए श्रवण बुल्ला और कैप्सूल उन्मुख करने के लिए कैसे पता चलता है।
यहाँ, हम एक विधि श्रवण बुल्ला और प्रसव के बाद चूहों में कैप्सूल को अलग-थलग करने के लिए उपयोगी प्रस्तुत करते हैं। P12 के लिए पहले, ऊतकों कमजोर कर रहे हैं और अलगाव के दौरान क्षतिग्रस्त हो सकता है। P12 के बाद, श्रवण बुल्ला और कैप्सूल आसानी से आसपास के ऊतकों से अलग किया जा सकता है। सेक्शनिंग से पहले सिर से बुल्ला विदारक कई फायदे हैं। सबसे पहले, प्रसव के बाद cavitation और श्रवण बुल्ला के विकास के सबसे सक्रिय रूप से पी 6 के बाद से पाए जाते हैं और P14 50 से पूरा कर रहे हैं। कान की झिल्ली और कर्णावत दीवार के बीच mesenchymal ऊतक cavitation प्रक्रिया के माध्यम से हवा की जगह है। मध्य कान गुहा में परिणामी हवा निर्धारण, विकैल्सीकरण और embedding के दौरान ऊतकों और तरल पदार्थ के बीच संपर्क बाधित कर सकते हैं। यह पूर्वकाल अंत (styliform प्रक्रिया) को काटने के बजाय unisolated बुल्ला में ऐसा करने की कोशिश कर रहा द्वारा पृथक श्रवण बुल्ला से हवा निकालने के लिए आसान है। दूसरा, कान में की हड्डी (और कान की झिल्ली) के उन्मुखीकरण खड़ी नहीं हैसिर में। इसलिए यह एक दिया अभिविन्यास में पृथक श्रवण बुल्ला और कैप्सूल embedding द्वारा खंड के लिए आसान वांछित विमानों में कान में की हड्डी है।
एक बार अलग, श्रवण बुल्ला और कैप्सूल कई विश्लेषण के लिए उपयोगी होते हैं। उदाहरण के लिए, उच्च संकल्प एक्स-रे सूक्ष्म सीटी इस तरह के कान में की हड्डी 14 में osteogenic केशिकाओं के रूप में हड्डी microstructure आकृति विज्ञान प्रकट कर सकते हैं। Stereofluorescence विदारक माइक्रोस्कोप मध्य या भीतरी कान 33 में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त संवाददाता चूहों के मूल्यांकन में संरचनाओं कल्पना करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इसके अलावा, विवो या पूर्व vivo प्रतिदीप्ति लेबलिंग तरीकों और पूरे माउंट immunofluorescence का पता लगाने में विभिन्न कार्य शुरू किया जा सकता है। हल्की चादर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी भी तीन आयामी विश्लेषण 51 के लिए उपयोगी है। हालांकि यहाँ वर्णित नहीं है, विविध शारीरिक संरचनाओं श्रवण बुल्ला और इस तरह परिधीय नसों, रक्त वाहिकाओं के रूप में कैप्सूल के साथ जुड़े हैं, औरमध्य कान में कान की झिल्ली भी इस प्रोटोकॉल का उपयोग का मूल्यांकन किया जा सकता है।
ध्यान दें कि आयल सेक्शनिंग और embedding से पहले हड्डी के ऊतकों के विकैल्सीकरण की आवश्यकता है इसलिए खनिज के विश्लेषण की अनुमति नहीं है। इसके विपरीत, कावामोटो फिल्म विधि 43 जमे हुए वर्गों तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया विकैल्सीकरण बिना किया जा सकता है और इन विवो अस्थि-लेबलिंग तकनीक या इस तरह के Alizarin धुंधला के रूप में विशेष धुंधला में उपयोग करते हुए खनिज के अध्ययन के लिए उपयुक्त है। क्रायो सेक्शनिंग की स्थिति माउस उम्र के आधार पर अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, cryostat कक्ष के अंदर एक कम ठंडे तापमान पुराने माउस नमूनों के लिए सिफारिश की है वर्गों को नुकसान को कम करने के लिए।
माउस में, कान में की हड्डी के प्रमुख अर्द्ध गोलाकार फलाव के लिए सही शब्द "गोलाकार एपोफ़ाइसिस" है। फिर भी, शब्द "प्रक्रिया ब्रेविस" व्यापक रूप से अधिक वीं के लिए गोलाकार एपोफ़ाइसिस इंगित करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैएक दो दशकों में, विशेष रूप से माउस विकासात्मक जीव 16,20,22-25 के बीच में। "प्रक्रिया ब्रेविस" मूल रूप से पार्श्व प्रक्रिया (प्रक्रिया lateralis), जो गोलाकार एपोफ़ाइसिस से अलग करने के लिए भेजा। मनुष्यों में, एक पार्श्व प्रक्रिया एक मामूली शंक्वाकार प्रक्षेपण जैसी manubrium (न चित्रा 6B, औसत दर्जे का ध्यान में रखते हुए देखा है) से देने कान की झिल्ली को कुर्की के सामान्य लाइन रूपों। चूहों में, पार्श्व प्रक्रिया भी umbo से 48 विपरीत अंत में manubrium के एक प्रक्षेपण है। कान की झिल्ली की पार्स flaccida कान में की हड्डी के पार्श्व प्रक्रिया से ऊपर है। गोलाकार एपोफ़ाइसिस मानव कान में की हड्डी में स्पष्ट नहीं है।
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.
Tools/Equipment | |||
Paper towel | DAIO PAPER CORPORATION | 703347 | can be purchased from other vendors |
Glass Jar | Various | can be purchased from other vendors | |
14cm surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 91400-14 | can be purchased from other vendors |
Extra fine scissors-straight | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14084-08 | can be purchased from other vendors |
Fine Forceps Angled 45° | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11063-07 | can be purchased from other vendors |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ800N | for routine dissection |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ18 | for movies |
Injection needle 27G | TERUMO | NN-2719S | |
Syringe (1ml) | TERUMO | SS-01T | |
Marking Pin | Various | ||
Tube rotator RT-50 | TAITEC | 0000165-000 | can be purchased from other vendors |
Cryostat | Leica | CM3050S | http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/ |
TC-65 Tungsten blade | Leica | 14021626379 | for Kawamoto's firm method |
Stainless containers | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Cryofilm type IIC | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Silane coated slide (New Silane II) | Muto Pure Chemicals | 511617 | can be purchased from other vendors |
Cover glass | Matsunami | can be purchased from other vendors | |
Tissue processor | Sakura Finetek | VIP-5 | can be purchased from other vendors |
Tissue Embedding Console System | Sakura Finetek | Tissue-Tek TEC 5 | can be purchased from other vendors |
Sliding microtome for paraffin | Yamato Kohki Industrial | REM-710 | can be purchased from other vendors |
Path Blade+pro for hard tissue | Matsunami | PB3503C | for paraffin section |
Micro-CT | RIGAKU | R_mCT2 | http://www.rigaku.com/en |
Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Isoflurane | Maruishi pharmaceutical Co. Ltd | ||
NaCl | wako | 191-01665 | for PBS |
KCl | wako | 285-14 | for PBS |
Na2HPO4 12H2O | wako | 196-02835 | for PBS |
KH2PO4 | wako | 287-21 | for PBS |
Paraformaldehyde(EM Grade) | TAAB | P001 | |
EDTA-2Na | wako | 15111-45 | |
Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
Super Cryoembedding Medium | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Dry Ice | Various | for Kawamoto's firm method | |
Hexane | wako | 080-03423 | for Kawamoto's firm method |
Super Cryomouting Medium type R2 | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Paraffin | Sakura Finetek | 781001A0107 | |
Histo-Clear | NDS | HS-200 | |
Calcein | DOJINDO | 340-00433 | |
Hematoxylin | wako | 131-09665 | |
Eosin | wako | 051-06515 |