We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.
I de flesta däggdjur, hörselbenen i mellanörat, inklusive hammaren, städet och stigbygeln, är de minsta benen. I möss, som kallas en benig struktur hörsel bulla inrymmer hörselbenen, medan hörsel kapseln omsluter innerörat, nämligen snäckan och båggångarna. Murina ossicles är en förutsättning för att höra och därmed av stort intresse för forskare inom området otolaryngologi, men deras ämnesomsättning, utveckling, och utveckling är mycket relevanta för andra områden. Förändrad benmetabolismen kan påverka hörselfunktion hos vuxna möss, och olika gen-brist möss visar förändringar i morfogenes av hörselbenen i livmodern. Även murina hörselbenen är liten, är deras manipulation möjlig om man förstår deras anatomiska orientering och 3D-struktur. Här beskriver vi hur att dissekera hörsel bulla och kapsel av postnatal möss och sedan isolera enskilda hörselbenen genom att ta bort en del av bulla. Vi diskuterar också hur man emsäng bulla och kapsel i olika riktningar för att generera paraffin eller frysta snitt lämpliga för framställning av längsgående, horisontella eller frontal delar av hammaren. Slutligen, vi räkna anatomiska skillnader mellan mus och mänskliga hörselhörselbenen. Dessa metoder skulle vara användbart vid analys av patologiska, utvecklingsmässiga och evolutionära aspekter av hörselhörselbenen och mellanörat hos möss.
De tre auditiva hörselbenen i mellanörat, nämligen de malleus, incus och stapes, bildar en däggdjursspecifika auditiv kedja som överför ljud från trumhinnan till innerörat, eller cochlea 1,2. Hörselfunktion kan utvärderas i möss genom att mäta Auditory Brainstem svar (ABR) trösklar 3-6, och vibration av malleus bakom trumhinnan kan övervakas med användning av Laser Doppler Vibrometry (LDV) 7. Genom att kombinera ABR, LDV och Distortion produkt otoakustiska emissioner (DPOAE) mätningar, kan konduktiv hörselnedsättning kan särskiljas från sensorineural försämring 8.
Det behövs djurmodeller av örat villkor, med tanke på betydelsen av att höra och öra hälsa välbefinnande av patienter i alla åldrar. Till exempel, är inflammation i mellanörat en oerhört gemensam öroninfektion ses i humana spädbarn och barn, och allvarliga, akut otitis media och dess komplikationer kan inträffa om condining är inte behandlas med lämpliga antimikrobiella 9. Musmodeller av öroninflammation kan visa sig användbart för att förstå patogenesen och utveckla behandlingar 10,11.
Murina hörselbenen, som (med undantag för goniale del av hammaren) bildas av endokondral benbildning 12,13, är av stor betydelse för studiet av benmetabolism och morfogenes. För det första medger deras lilla storlek med hög upplösning analys av ben med en intakt benhinna med användning av röntgen eller fluorescensmikroskopi 14. För det andra, avvikande benmetabolism, såsom överdriven eller bristfällig benresorption, eller nedsatt interaktioner mellan benceller 15, kan analyseras som en potentiell bidragande orsak till hörselnedsättning 3,4,7. Tredje, onormal LITET BEN morfogenes rapporteras i flera gen-defekta möss, såsom djur som saknar Hoxa2 16-19, Msx1 20-22, Prrx1 23, gsc(GSC) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27 Noggin (Nog) 28, FGFR1 29 sköldkörtelhormonreceptorer (Thra, Thrb) 5, BCL2 30 och andra 1,31, eller i möss som överuttrycker Hoxa2 32. Slutligen, trots sin ringa storlek, strukturer i samband med hörselbenen såsom muskler 33 och leder 34,35 är tillgängliga.
Mus ossicles är mindre än mänskliga hörselbenen, men det är anmärkningsvärt att musen mellanörat är inte en miniatyr av dess mänskliga motsvarighet. Till exempel, i möss, den stapedial artär, som passerar genom ringen av stigbygeln, kvarstår under hela livet 36, medan i människor, försvinner den embryonala stapedial artären under dräktigheten. Dessutom morfologin hos mus malleus skiljer sig från den hos the humant ben (se figur 6). Hos möss, omsluter den auditiva (tympanic) bulla den luftfyllda mellanörats hålrum, medan hos människor, mastoideus luftceller sammansatta av trabekulärt ben i tinningbenet inrymmer hörselbenen i stället för en bulla 37. I båda arterna, hörsel kapseln (öron kapsel, benlabyrinten) omsluter snäckan och båggångarna i innerörat. Jämförande och evolutionsbiologi i mellanörat har i stor utsträckning över 38-40.
Protokollet nedan först beskriver hur man dissekera ut hörsel bulla och kapsel, som består i huvudsak av mellanörat och innerörat, respektive. Detta protokoll visar också hur man isolera hammaren, städet och stigbygeln från hörsel bulla. Slutligen visar det sig att orientera hörsel bulla och kapsel för inbäddning i förberedelse för vävnadssnittning av hörselbenen.
Här presenterar vi en metod som är användbar för att isolera hörsel bulla och kapsel i postnatal möss. Före P12, vävnader är ömtåliga och kan skadas under isolering. Efter P12, kan den auditiva bulla och kapseln lätt isoleras från omgivande vävnader. Dissekera bulla från huvudet innan snitt har flera fördelar. Först, postnatal kavitation och tillväxt av hörsel bulla uppträder mest aktivt från P6 och framåt och är komplett med P14 50. Den mesenkymala vävnaden mellan trumhinnan och cochlea vägg ersätts med luft genom kavitation processen. Den resulterande luft i mellanörat kaviteten kan hindra kontakt mellan vävnader och vätskor under fixeringen, avkalkning och inbäddning. Det är lättare att ta bort luft från den isolerade hörsel bulla genom att skära av den främre änden (styliform process) snarare än att försöka göra det i oisolerade bulla. För det andra, inte är vertikal orientering av malleus (med trumhinnan)i huvudet. Det är därför lättare att avsnittet hammaren i önskade plan genom att bädda in den isolerade hörsel bulla och kapsel i en viss riktning.
När isolerade, hörsel bulla och kapslar är användbara för många analyser. Till exempel, kan hög upplösning röntgenmikro CT avslöjar ben mikrostruktur morfologi såsom osteogena kapillärer i malleus 14. Den stereofluorescence dissekera mikroskop är ett kraftfullt verktyg för att visualisera strukturer utvärdera reporter möss som uttrycker fluorescerande proteiner i mitten eller innerörat 33. Dessutom, olika in vivo eller ex vivo fluorescensmärkningsmetoder och hela montera immunofluorescens detektion skulle kunna genomföras. Ljus ark fluorescensmikroskopi är också användbart för tredimensionell analys 51. Även om det inte beskrivs här, olika anatomiska strukturer i samband med hörsel bulla och kapsel såsom perifera nerver, blodkärl, ochtrumhinnan i mellanörat kan också utvärderas med hjälp av detta protokoll.
Observera att paraffinsektionering kräver avkalkning av benvävnad före inbäddning och därför inte tillåter analys av mineralisering. Däremot kan den Kawamoto filmmetod 43 användes för att framställa frusna snitt utföras utan urkalkning och är lämplig för mineralisering studier med användning av in vivo ben-märkningstekniker eller speciella färgning såsom Alizarin färgning. Cryo-sektione villkor bör optimeras enligt baserad på mus ålder. Till exempel, är en mindre sval temperatur inuti kryostaten kammaren rekommenderas till äldre mus prover för att minimera skador på sektioner.
I mus, är den korrekta termen för den framstående halvsfäriska utsprång av hammaren "orbicular apophysis". Ändå har termen "processus brevis" i stor utsträckning använts för att ange orbicular apophysis för mer then två decennier, i synnerhet bland mus utvecklings biologer 16,20,22-25. "Processus brevis" ursprungligen till den laterala processen (processus later), som skiljer sig från den orbicular apophysis. Hos människa, en lateral process som liknar en liten konisk projektion bildar den allmänna linjen i anslutning till trumhinnan, som sträcker sig från manubrium (inte sett i figur 6B, medial vy). I möss, är den laterala process också en projektion av manubrium vid den motsatta änden till Umbo 48. Pars flaccida av trumhinnan är över den laterala processen med malleus. Orbicular apophysis framgår inte i den mänskliga hammaren.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.
Tools/Equipment | |||
Paper towel | DAIO PAPER CORPORATION | 703347 | can be purchased from other vendors |
Glass Jar | Various | can be purchased from other vendors | |
14cm surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 91400-14 | can be purchased from other vendors |
Extra fine scissors-straight | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14084-08 | can be purchased from other vendors |
Fine Forceps Angled 45° | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11063-07 | can be purchased from other vendors |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ800N | for routine dissection |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ18 | for movies |
Injection needle 27G | TERUMO | NN-2719S | |
Syringe (1ml) | TERUMO | SS-01T | |
Marking Pin | Various | ||
Tube rotator RT-50 | TAITEC | 0000165-000 | can be purchased from other vendors |
Cryostat | Leica | CM3050S | http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/ |
TC-65 Tungsten blade | Leica | 14021626379 | for Kawamoto's firm method |
Stainless containers | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Cryofilm type IIC | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Silane coated slide (New Silane II) | Muto Pure Chemicals | 511617 | can be purchased from other vendors |
Cover glass | Matsunami | can be purchased from other vendors | |
Tissue processor | Sakura Finetek | VIP-5 | can be purchased from other vendors |
Tissue Embedding Console System | Sakura Finetek | Tissue-Tek TEC 5 | can be purchased from other vendors |
Sliding microtome for paraffin | Yamato Kohki Industrial | REM-710 | can be purchased from other vendors |
Path Blade+pro for hard tissue | Matsunami | PB3503C | for paraffin section |
Micro-CT | RIGAKU | R_mCT2 | http://www.rigaku.com/en |
Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Isoflurane | Maruishi pharmaceutical Co. Ltd | ||
NaCl | wako | 191-01665 | for PBS |
KCl | wako | 285-14 | for PBS |
Na2HPO4 12H2O | wako | 196-02835 | for PBS |
KH2PO4 | wako | 287-21 | for PBS |
Paraformaldehyde(EM Grade) | TAAB | P001 | |
EDTA-2Na | wako | 15111-45 | |
Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
Super Cryoembedding Medium | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Dry Ice | Various | for Kawamoto's firm method | |
Hexane | wako | 080-03423 | for Kawamoto's firm method |
Super Cryomouting Medium type R2 | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Paraffin | Sakura Finetek | 781001A0107 | |
Histo-Clear | NDS | HS-200 | |
Calcein | DOJINDO | 340-00433 | |
Hematoxylin | wako | 131-09665 | |
Eosin | wako | 051-06515 |