We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.
En la mayoría de los mamíferos, huesecillos del oído medio, incluyendo el martillo, yunque y estribo, son los huesos más pequeños. En ratones, una estructura ósea llamada la bulla auditiva alberga la cadena de huesecillos, mientras que la cápsula auditiva encierra el oído interno, a saber, la cóclea y canales semicirculares. huesecillos murinos son esenciales para la audición y por lo tanto de gran interés para los investigadores en el campo de la otorrinolaringología, pero su metabolismo, el desarrollo y la evolución son altamente relevantes para otros campos. Metabolismo óseo alterado puede afectar la función de la audición en ratones adultos, y varios ratones de genes deficientes en mostrar cambios en la morfogénesis de los huesecillos del oído en el útero. A pesar de huesecillos del oído murinos son pequeñas, su manipulación es factible si uno entiende su orientación anatómica y la estructura 3D. A continuación, describimos cómo diseccionar la bulla auditiva y la cápsula de ratones postnatales y luego aislar huesecillos individuales mediante la eliminación de parte de la bulla. También discutimos cómo emcama la bulla y la cápsula en diferentes orientaciones para generar parafina o secciones congeladas adecuados para la preparación de secciones longitudinales, horizontales, o frontales del martillo. Por último, se apuntan las diferencias anatómicas entre el ratón y huesecillos del oído humano. Estos métodos serían útiles en el análisis de los aspectos patológicos, de desarrollo y evolutivas de huesecillos del oído y el oído medio en ratones.
Los tres huesecillos del oído del oído medio, a saber los martillo, yunque y estribo, forman una cadena auditivo mamífero específico que transmite el sonido de la membrana timpánica en el oído interno, o cóclea 1,2. La función auditiva puede ser evaluada en ratones mediante la medición de la respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR) Umbrales de 3-6, y la vibración del martillo detrás de la membrana timpánica pueden ser monitoreados utilizando láser Doppler vibrometría (LDV) 7. Mediante la combinación de la ABR, LDV, y mediciones de productos de distorsión de emisiones otoacústicas (DPOAE), pérdida de audición conductiva puede ser discriminado por deterioro neurosensorial 8.
Se necesitan modelos animales de enfermedades del oído, dada la importancia de la audición y la salud del oído para el bienestar de los pacientes de todas las edades. Por ejemplo, la otitis media es una infección de oído muy común que se observa en lactantes y niños humanos, y graves, otitis media aguda y sus complicaciones puede ocurrir si la condición no se trata con antibióticos apropiados 9. Los modelos de ratón de la otitis media podrían resultar útiles en la comprensión de la patogénesis y en el desarrollo de tratamientos 10,11.
Osículos murino, que (excepto por la parte goniale del martillo) se forman por osificación endocondral 12,13, son altamente relevantes para el estudio de metabolismo de los huesos y la morfogénesis. En primer lugar, su pequeño tamaño permite un análisis de alta resolución de los huesos con un periostio intacto el uso de rayos X o la microscopía de fluorescencia 14. En segundo lugar, el metabolismo óseo aberrantes, tales como la resorción ósea excesiva o deficiente, o interacciones con discapacidad entre las células óseas 15, puede ser analizada como un contribuyente potencial para la audición 3,4,7 pérdida. En tercer lugar, la morfogénesis de huesecillos anormal se informa en varios ratones con deficiencia de genes, tales como los animales que carecen Hoxa2 16-19, 20-22 MSX1, Prrx1 23, goosecoid(GSC) 24,25, Bapx1 13, 26 Tshz1, dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, 29 Fgfr1, receptores de hormonas tiroideas (Thra, thrB) 5, Bcl2 30 y otros 1,31, o en ratones que sobreexpresan Hoxa2 32. Por último, a pesar de su pequeño tamaño, las estructuras asociadas con huesecillos tales como los músculos y las articulaciones 33 34,35 son accesibles.
huesecillos del ratón son más pequeños que los huesecillos humanos, pero hay que destacar que el oído medio del ratón no es una versión en miniatura de su homólogo humano. Por ejemplo, en ratones, la arteria estapedial, que pasa a través del anillo del estribo, persiste durante toda la vida 36, mientras que en los seres humanos, la arteria estapedial embrionario desaparece durante la gestación. Además, la morfología del martillo de ratón difiere de la de THhueso humano e (ver Figura 6). En ratones, la auditiva (timpánica) bulla encierra la cavidad del oído medio lleno de aire, mientras que en los seres humanos, las células mastoideas compuestas de hueso trabecular en el hueso temporal alberga la cadena de huesecillos en lugar de una bulla 37. En ambas especies, la cápsula auditiva (cápsula ótica, laberinto óseo) encierra la cóclea y los canales semicirculares del oído interno. La biología comparativa y evolutiva del oído medio ha sido revisado extensamente 38-40.
El protocolo previsto inferior a la primera se describe cómo diseccionar la bulla auditiva y de la cápsula, que consisten principalmente en el oído medio y el oído interno, respectivamente. Este protocolo también demuestra cómo aislar el martillo, yunque y estribo de la bulla auditiva. Por último, muestra cómo orientar la bulla auditiva y de la cápsula para incrustar en preparación para seccionar los tejidos de los huesecillos del oído.
A continuación, presentamos un método útil para aislar la bulla auditiva y de la cápsula en ratones postnatales. Antes de P12, los tejidos son frágiles y pueden dañarse durante el aislamiento. Después de P12, la bulla auditiva y la cápsula pueden ser fácilmente aislados de los tejidos circundantes. La disección de la bulla de la cabeza antes de seccionar tiene varias ventajas. En primer lugar, la cavitación y el crecimiento posnatal de la bulla auditiva se presentan con más activamente de P6 en adelante y están completos, por P14 50. El tejido mesenquimal entre la membrana timpánica y la pared coclear se sustituye por aire a través del proceso de cavitación. El aire resultante en la cavidad del oído medio puede impedir el contacto entre los tejidos y líquidos durante la fijación, la descalcificación y la incrustación. Es más fácil de eliminar el aire de la bulla auditiva aislados cortando el final (proceso styliform) anterior en lugar de intentar hacerlo en la bulla no aislado. En segundo lugar, la orientación del martillo (y la membrana timpánica) no es verticalEn la cabeza. Por tanto, es más fácil de la sección del martillo en planos deseados mediante la incorporación de la bulla auditiva aislado y la cápsula en una orientación determinada.
Una vez aislado, bulla auditiva y cápsulas son útiles para numerosos análisis. Por ejemplo, la alta resolución de rayos X de micro-CT puede revelar la morfología de la microestructura del hueso tales como capilares osteogénicas en el martillo 14. El microscopio de disección stereofluorescence es una poderosa herramienta para visualizar estructuras en la evaluación de reportero ratones que expresan las proteínas fluorescentes en el oído medio o interno 33. Además, varios in vivo o ex vivo de fluorescencia métodos de marcaje y detección de inmunofluorescencia conjunto de montaje podrían llevarse a cabo. La microscopía de fluorescencia hoja de luz también es útil para el análisis tridimensional 51. Aunque no se describe aquí, las diversas estructuras anatómicas asociadas con la bulla auditiva y la cápsula tales como nervios periféricos, los vasos sanguíneos, yla membrana timpánica en el oído medio también se puede evaluar usando este protocolo.
Tenga en cuenta que el seccionamiento de parafina requiere descalcificación de tejidos óseos antes de la incrustación y por lo tanto no permite el análisis de la mineralización. Por el contrario, el método de película Kawamoto 43 usado para preparar las secciones congeladas se puede realizar sin descalcificación y es adecuado para estudios de mineralización utilizando en técnicas de etiquetado de hueso in vivo o tinción especial tal como la tinción de alizarina. condiciones de crio-seccionamiento deben optimizarse según basada en la edad del ratón. Por ejemplo, se recomienda una temperatura de menos fresco dentro de la cámara del criostato para las muestras más antiguas de ratón para minimizar el daño a las secciones.
En el ratón, el término correcto para el prominente protuberancia semiesférica del martillo es "apófisis orbicular". Sin embargo, el término "brevis processus" ha sido ampliamente utilizado para indicar la apófisis orbicular para más THotros dos décadas, en particular entre los biólogos del desarrollo del ratón 16,20,22-25. "Processus brevis" originalmente se refería al proceso lateral (processus lateralis), que difiere de la apófisis orbicular. En los seres humanos, un proceso lateral se asemeja a una ligera proyección cónica forma la línea general de unión a la membrana timpánica, que se extiende desde el manubrio (no se ve en la figura 6B, la vista medial). En ratones, el proceso lateral es también una proyección del manubrio en el extremo opuesto a la umbo 48. La pars flaccida de la membrana timpánica está por encima del proceso lateral del martillo. apófisis orbiculares no es evidente en el martillo humano.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.
Tools/Equipment | |||
Paper towel | DAIO PAPER CORPORATION | 703347 | can be purchased from other vendors |
Glass Jar | Various | can be purchased from other vendors | |
14cm surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 91400-14 | can be purchased from other vendors |
Extra fine scissors-straight | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14084-08 | can be purchased from other vendors |
Fine Forceps Angled 45° | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11063-07 | can be purchased from other vendors |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ800N | for routine dissection |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ18 | for movies |
Injection needle 27G | TERUMO | NN-2719S | |
Syringe (1ml) | TERUMO | SS-01T | |
Marking Pin | Various | ||
Tube rotator RT-50 | TAITEC | 0000165-000 | can be purchased from other vendors |
Cryostat | Leica | CM3050S | http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/ |
TC-65 Tungsten blade | Leica | 14021626379 | for Kawamoto's firm method |
Stainless containers | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Cryofilm type IIC | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Silane coated slide (New Silane II) | Muto Pure Chemicals | 511617 | can be purchased from other vendors |
Cover glass | Matsunami | can be purchased from other vendors | |
Tissue processor | Sakura Finetek | VIP-5 | can be purchased from other vendors |
Tissue Embedding Console System | Sakura Finetek | Tissue-Tek TEC 5 | can be purchased from other vendors |
Sliding microtome for paraffin | Yamato Kohki Industrial | REM-710 | can be purchased from other vendors |
Path Blade+pro for hard tissue | Matsunami | PB3503C | for paraffin section |
Micro-CT | RIGAKU | R_mCT2 | http://www.rigaku.com/en |
Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Isoflurane | Maruishi pharmaceutical Co. Ltd | ||
NaCl | wako | 191-01665 | for PBS |
KCl | wako | 285-14 | for PBS |
Na2HPO4 12H2O | wako | 196-02835 | for PBS |
KH2PO4 | wako | 287-21 | for PBS |
Paraformaldehyde(EM Grade) | TAAB | P001 | |
EDTA-2Na | wako | 15111-45 | |
Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
Super Cryoembedding Medium | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Dry Ice | Various | for Kawamoto's firm method | |
Hexane | wako | 080-03423 | for Kawamoto's firm method |
Super Cryomouting Medium type R2 | Leica | for Kawamoto's firm method | |
Paraffin | Sakura Finetek | 781001A0107 | |
Histo-Clear | NDS | HS-200 | |
Calcein | DOJINDO | 340-00433 | |
Hematoxylin | wako | 131-09665 | |
Eosin | wako | 051-06515 |