Criosezionamento di regioni contigue di un muscolo scheletrico mouse unico per l'espressione genica e analisi istologiche

Sommario

Consecutivi crio-sezioni sono raccolti per consentire alle applicazioni istologiche e l'arricchimento di RNA per misure di espressione genica utilizzando zone adiacenti da un muscolo scheletrico singolo mouse. RNA di alta qualità si ottiene da 20 - 30 mg di criosezioni e le misure messe in comune sono direttamente confrontato tra le applicazioni.

Abstract

Con questo metodo, criosezioni consecutivi sono raccolti per permettere alle applicazioni di microscopia per istologia dei tessuti e l'arricchimento di RNA per l'espressione genica utilizzando zone adiacenti da un muscolo scheletrico singolo mouse. In genere, è difficile da ottenere una adeguata omogeneizzazione dei piccoli campioni del muscolo scheletrico a causa volumi buffer può essere troppo bassa per le applicazioni di macinazione efficiente, ma senza sufficiente rottura meccanica, l'architettura del tessuto denso di limiti muscolari penetrazione dei reagenti tampone, in ultima analisi, causando bassa resa di RNA. Seguendo il protocollo qui riportato, 30 sezioni micron sono raccolti ed aggregati permettendo criosezionamento e successiva omogeneizzazione ago per interrompere meccanicamente il muscolo, aumentando l'area superficiale esposta per la penetrazione buffer. I limiti principali della tecnica sono che richiede un criostato, ed è relativamente ridotto. Tuttavia, RNA di alta qualità può essere ottenuto da piccoli campioni di m poolcriosezioni uscle, rendendo questo metodo accessibile per molti muscoli scheletrici diversi e altri tessuti. Analisi Inoltre, questa tecnica permette abbinato (ad esempio, istopatologia tessuto e di espressione genica) dalle regioni adiacenti di un singolo muscolo scheletrico in modo che le misurazioni sono direttamente confrontabili tra applicazioni per ridurre l'incertezza sperimentale e per ridurre gli esperimenti su animali replicativi necessario fonte un piccolo tessuto per la applicazioni multiple.

Introduzione

L'obiettivo di questa tecnica è quello di rendere più analisi sperimentali diverse modalità, quali l'espressione genica e istologia, accessibili da un unico piccolo tessuto d'origine muscolo scheletrico. applicazioni Microscopia sono più sensibili al campione metodi di conservazione, che devono essere controllati con attenzione per limitare la formazione di manufatti cristalli di ghiaccio durante crioconservazione. Pertanto, lo sviluppo del metodo si basa sulla tibiale anteriore (TA) muscolare congelati parzialmente coperto di incorporamento di resina in un raffreddato con azoto liquido vasca 2-metilbutano -140 ° C come materiale sorgente per immunofluore....

Protocollo

Tutte le procedure di animali sono state approvate dalla Università della Georgia Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso in condizioni di utilizzo degli animali protocollo A2013 07-016 (Beda).

1. La crioconservazione di non fissato muscolo scheletrico

1. Preparazione
   1. Tagliare il sughero in piccoli quadrati (circa 1 cm x 1 cm) con una lama di rasoio, scrivere sul sughero con un pennarello punta fine che è resistente alla 2-metilbutano per identificare il mouse sorgente e muscolare, e fare un taglio molto bassa (circa 1mm) sulla superficie superiore. Inserire un vetrino di plastica nel taglio da utilizzare per orientare il tessuto.....

Risultati

Muscle cryosection RNA è ad alto contenuto di qualità e fornisce il rendimento sufficiente per la maggior parte delle applicazioni

Analisi di sedici preparati di RNA muscolo scheletrico sono mostrati nella Tabella 1 utilizzando 19,4 a 41 mg di pool muscolo tibiale anteriore (TA) da 8 topi di controllo. Sia a sinistra (L) e destra muscoli (R) TA sono stati preparati in esperimenti di rigenerazione con muscoli racc.......

Discussione

Per ottenere i migliori risultati con questo metodo, tenere embedding resina limitato al terzo inferiore o mezza del muscolo durante la crioconservazione di tessuto, perché la resina in eccesso rallenta la raccolta dei criosezioni pool e può aumentare l'incorporamento contaminazione resina nell'isolamento dell'RNA. Inoltre, attenzione durante dell'ago omogeneizzazione è importante per ottimizzare il rendimento e minimizzare la probabilità di intasamento dell'ago. Il protocollo può essere modificato u.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sughero	VWR Scientific	23420-708	Tagliare in piccoli quadrati con una lama affilata.
Vetrino coprioggetti in plastica	Fisher Scientific	12-547	Utilizzato per orientare il muscolo durante il congelamento.
Termometro a bassa temperatura	VWR Scientific	89370-158
2-metilbutano	Sigma	M32631-4L	Attenzione: sostanza chimica pericolosa. Conservare in un armadio infiammabile.
Resina di inclusione: "cryomatrix"	Thermo Fisher Scientific	6769006	Altre resine di inclusione possono essere sostituite alla cryomatrix.
Criostato	Thermo Fisher Scientific	microm HM550 con portalama monouso	Qualsiasi criostato funzionante dovrebbe essere sufficiente per il protocollo.
Lama monouso per criostato	Thermo Fisher Scientific	3052835	Utilizzare una lama o un coltello appropriati per il criostato da utilizzare.
Soluzione di decontaminazione dell'RNAsi: "RNase Zap"	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Bilancia analitica	Mettler Toledo	XS64
Pennello	Daler Rowney	214900920	Utilizzare per gestire le criosezioni. Può essere trovato nei negozi con semplici forniture artistiche.
Lama di rasoio	VWR Scientific	55411-050
Vetrino per microscopio	VWR Scientific	48311600
Reagente per estrazione organica a RNA: TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026	Attenzione: TRIzol è una sostanza chimica pericolosa. Nota: per l'estrazione dell'RNA dal muscolo scheletrico si raccomandano solo reagenti di estrazione organica.
Ago calibro 18	VWR Scientific	BD305185
ago calibro 22	VWR Scientific	BD305155
ago calibro 26	VWR Scientific	BD305115	Opzionale. Può essere utilizzato per un terzo ciclo di triturazione del campione nel protocollo di estrazione dell'RNA.
Siringa da 1 ml	VWR Scientific	BD309659	Per campioni di valore molto elevato, si consiglia una siringa Luer-Lok (es., VWR BD309628).
1-bromo-3-cloropentano (BCP)	Sigma	B9673
Per il 70% di etanolo in acqua DEPC: 200 alcol proof	Decon Laboratories, Inc.	+M18027161M	Mescolare 35 ml di alcol a 200 gradi + 15 ml di acqua DEPC.
Per il 70% di etanolo in acqua DEPC: acqua trattata con DEPC	Thermo Fisher Scientific	AM9922	Mix 35 ml di alcol 200 proof + 15 ml di acqua DEPC.
Kit di purificazione dell'RNA: PureLink RNA minikit	Thermo Fisher Scientific	12183018A	Fasi finali della preparazione dell'RNA.
Acqua priva di DNasi/RNASI	È possibile utilizzare anche acqua trattata	con Gibco	10977
Spettrofotometro: Nanodrop 2000	Thermo Fisher Scientific NanoDrop	2000
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	AM2222	Trattare l'RNA purificato per rimuovere qualsiasi contaminazione del DNA prima delle applicazioni a valle.
Penna idrofobica	Thermo Fisher Scientific	8899
Dulbecco's PBS	Gibco	14190	PBS per protocollo di immunofluorescenza.
Siero d'asino	Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc	017-000-121	Reidratare il normale stock di siero d'asino secondo le istruzioni del produttore, quindi diluire un'aliquota al 5% per l'immunofluorescenza. Può essere utilizzato anche il normale siero di capra.
eMHC Anticorpo	Università dell'Iowa Studi sullo sviluppo Ibridoma Banca	F1.652
Anticorpo Collagene VI	Fitzgerald Industries	#70R-CR009x
Asino anti-coniglio AlexaFluor488	Thermo Fisher Scientific	A21206
Capra anti-topo IgG1 AlexaFluor546	Thermo Fisher Scientific	A21123
DAPI (4',6- diamidino-2-fenilidolo)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Mezzi di montaggio acquosi: Permafluor	Thermo Fisher Scientific	TA-030-FM	Utilizzare solo mezzi di montaggio progettati per applicazioni fluorescenti con proprietà anti-sbiadimento.
Vetrino coprioggetti	VWR Scientific	16004-314	Utilizzo per il montaggio di vetrini alla fine del protocollo di immunofluorescenza
Software di analisi delle immagini: ImageProExpress	Media Cybernetics, Inc.	Image-Pro Express, o prodotti più avanzati	Freeware ImageJ dovrebbero funzionare anche per il conteggio manuale. Software più avanzati con capacità di segmentazione possono consentire una parziale automazione del processo; ad esempio, ImageProPremier.
Unisci e mappa le immagini delle sezioni: Photoshop	Adobe	Photoshop
Cardiotoxin	Sigma	C9659	Sigma C9659 è stato interrotto. Altre opzioni per la cardiotossina sono EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; o Ge Script # RP17303; Ma questi non sono stati convalidati.
Kit di trascrizione inversa: Sistema di sintesi del primo filamento Superscript III	Thermo Fisher Scientific	18080051	È possibile utilizzare qualsiasi reagente di trascrizione inversa convalidato e di alta qualità.
PCR standard: Sistema GoTaq Flexi polimerasi	Promega	M8298	È possibile utilizzare qualsiasi sistema Taq polimerasi convalidato e di alta qualità. Se il sequenziamento del DNA deve essere utilizzato per qualsiasi applicazione a valle della PCR, è necessario utilizzare un sistema PCR ad alta fedeltà.
SYBR verde	Thermo Fisher Scientific	S7585	Per l'uso in qPCR quando non si utilizza una master mix qPCR dedicata. Utilizzabile con SuperROX (per strumenti Applied Biosystems) e GoTaq Flexi polimerasi e tamponi.
ROX: SuperROX, 15 mM	BioResearch Technologies, Inc. Novato CA	SR-1000-10	SuperROX è più stabile nella reazione PCR, quindi è preferibile per l'uso come colorante di riferimento passivo qPCR rispetto a ROX (carbossi-X-rodamina). Per qPCR con strumenti Applied Biosystems
PCR in tempo reale	Applied Biosystems	7900HT

DEPC.