लगातार क्रायो वर्गों जीन अभिव्यक्ति एक माउस कंकाल की मांसपेशी से सटे क्षेत्रों का उपयोग माप के लिए ऊतकीय अनुप्रयोगों और आरएनए के संवर्धन के लिए सक्षम करने के लिए एकत्र कर रहे हैं। उच्च गुणवत्ता शाही सेना 20 से प्राप्त होता है – जमा cryosections और माप के 30 मिलीग्राम सीधे आवेदन भर में तुलना कर रहे हैं।
इस विधि के साथ, लगातार cryosections जीन अभिव्यक्ति के लिए ऊतक ऊतक विज्ञान और आरएनए के संवर्धन के लिए दोनों माइक्रोस्कोपी अनुप्रयोगों एक माउस कंकाल की मांसपेशी से सटे क्षेत्रों का उपयोग कर सक्षम करने के लिए एकत्र कर रहे हैं। आमतौर पर, यह छोटा सा कंकाल की मांसपेशी के नमूने की पर्याप्त homogenization के लक्ष्य को हासिल करने के लिए क्योंकि बफर मात्रा में कुशल पीस अनुप्रयोगों के लिए बहुत कम हो सकता है, अभी तक पर्याप्त यांत्रिक व्यवधान के बिना चुनौती दे रहा है, बफर अभिकर्मकों की पेशी सीमा प्रवेश के घने ऊतक वास्तुकला, अंततः कम शाही सेना उपज के कारण। प्रोटोकॉल यहां बताया पालन करके, 30 माइक्रोन वर्गों और एकत्र की इजाजत दी cryosectioning और बाद सुई homogenization यंत्रवत् मांसपेशियों को बाधित करने के लिए जमा, सतह बफर प्रवेश के लिए उजागर क्षेत्र बढ़ रही हैं। तकनीक के प्राथमिक सीमाओं कि यह एक cryostat की आवश्यकता है, और यह अपेक्षाकृत कम throughput है। हालांकि, उच्च गुणवत्ता शाही सेना जमा मीटर के छोटे नमूनों से प्राप्त किया जा सकताuscle cryosections, कई अलग अलग कंकाल की मांसपेशियों और अन्य ऊतकों के लिए इस विधि सुलभ बना रही है। इसके अलावा, इस तकनीक से मिलान के लिए सक्षम बनाता विश्लेषण (जैसे, ऊतक ऊतकविकृतिविज्ञानी और जीन अभिव्यक्ति) एक कंकाल की मांसपेशी के सटे क्षेत्रों से इतना है कि माप सीधे आवेदन पत्र प्रयोगात्मक अनिश्चितता को कम करने के लिए और स्रोत के लिए एक छोटा सा ऊतक आवश्यक replicative पशु प्रयोगों को कम करने के लिए भर में तुलना की जा सकती कई अनुप्रयोगों।
इस तकनीक का लक्ष्य ऐसे ऊतक विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति के रूप में विभिन्न तौर तरीकों, एक एकल छोटे कंकाल की मांसपेशी स्रोत के ऊतकों से सुलभ द्वारा कई प्रयोगात्मक विश्लेषण कर रहा है। माइक्रोस्कोपी अनुप्रयोगों सबसे संवेदनशील संरक्षण के तरीकों, जो ध्यान cryopreservation के दौरान बर्फ क्रिस्टल कलाकृतियों के गठन को सीमित करने की नियंत्रित किया जाना चाहिए नमूने के लिए कर रहे हैं। इस प्रकार, विधि विकास tibialis पूर्वकाल पर आधारित है (टीए) मांसपेशी आंशिक रूप से दोनों immunofluorescence माइक्रोस्कोपी और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए स्रोत सामग्री के रूप में एक -140 डिग्री सेल्सियस तरल नाइट्रोजन ठंडा 2-methylbutane स्नान में राल embedding के साथ कवर जमे हुए।
विविध तकनीकी दृष्टिकोण के लिए एक ही स्रोत सामग्री का उपयोग करने की आवश्यकता इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन आधारित प्रयोगों जहां छोड़ दिया और सही मांसपेशियों को अलग अलग परिस्थितियों, एक प्रयोगात्मक और एक नियंत्रण प्रतिनिधित्व करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, मांसपेशियों उत्थान के अध्ययन में, एक म्यूscle व्यापक ऊतकों को नुकसान पैदा करने के लिए है, जबकि contralateral मांसपेशी एक वाहन इंजेक्शन नियंत्रण 1 के रूप में कार्य करता है एक विष के साथ इंजेक्शन है। इसी तरह, मांसपेशियों विकारों के लिए जीन थेरेपी के अध्ययन के लिए आम तौर पर खाली वेक्टर, वेक्टर असंबंधित या contralateral ओर 2 पर वाहन पर नियंत्रण के साथ तुलना की जा इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन द्वारा जीन थेरेपी वेक्टर के सत्यापन के साथ शुरू करते हैं। इसलिए, यह एक अलग आवेदन करने के लिए स्रोत के लिए प्रत्येक टीए पेशी संभव नहीं है।
इस मुद्दे से निपटने के लिए आम रणनीतियों रहे हैं: i), प्रत्येक आवेदन के लिए एक अलग पेशी समूह का उपयोग करने के द्वितीय) अतिरिक्त चूहों का उपयोग करने के लिए, या iii) प्रत्येक आवेदन के लिए पेशी का एक टुकड़ा काट करने के लिए। हालांकि, मांसपेशी समूहों के बीच काफी मतभेद यह मुश्किल अलग अनुप्रयोगों से डेटा की तुलना करने के लिए बनाते हैं, और अतिरिक्त जानवरों खर्च में वृद्धि और खराब जायज़ है, तो अन्य विकल्प मौजूद हैं। विच्छेदन के बाद मांसपेशियों डिवाइडिंग स्रोत के लिए विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए सबसे अच्छा विकल्प है मैंn कई मामले हैं। हालांकि, मांसपेशियों टुकड़े अक्सर homogenization 2-5 के लिए तरल नाइट्रोजन या यांत्रिक पीस तकनीक के तहत दलन का उपयोग करने के लिए बहुत छोटे हैं। मांसपेशियों में एक अत्यधिक संरचनात्मक ऊतक बाह्य मैट्रिक्स और सिकुड़ा प्रोटीन के साथ पैक किया जाता है के रूप में, अपर्याप्त यांत्रिक homogenization के बाद डीएनए, आरएनए या प्रोटीन की कम उपज की ओर जाता है। विधि यहाँ विस्तृत कई अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए एक स्रोत पेशी से ऊतक की छोटी मात्रा की अनुमति देता है, और cryosectioning और सुई विचूर्णन के शामिल किए जाने के लिए बेहतर शाही सेना उपज के लिए यांत्रिक homogenization में सुधार।
इस विधि के साथ सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए, ऊतक cryopreservation के दौरान कम तीसरे या मांसपेशियों के आधे तक ही सीमित राल embedding रखने के कारण अतिरिक्त राल जमा cryosections के संग्रह धीमी हो जाएगी और आरएनए अलगाव में र?…
The authors have nothing to disclose.
Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre and Junna Luan provided technical assistance. Research reported in this publication was supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under award number AR065077. The content is solely the responsibility of the author and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Cork | VWR Scientific | 23420-708 | Cut into small squares with a sharp blade. |
Plastic coverslip | Fisher Scientific | 12-547 | Used to orient the muscle during freezing. |
Low temperature thermometer | VWR Scientific | 89370-158 | |
2-methylbutane | Sigma | M32631-4L | Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet. |
Embedding resin: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | Other embedding resins can be substituted for cryomatrix. |
Cryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 with disposable blade carrier | Any working cryostat should be sufficient for the protocol. |
Disposable cryostat blade | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used. |
RNAse decontamination solution: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
Analytical balance | Mettler Toledo | XS64 | |
Paint brush | Daler Rowney | 214900920 | Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies. |
Razor blade | VWR Scientific | 55411-050 | |
Microscope slide | VWR Scientific | 48311600 | |
RNA organic extraction reagent: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle. |
18 gauge needle | VWR Scientific | BD305185 | |
22 gauge needle | VWR Scientific | BD305155 | |
26 gauge needle | VWR Scientific | BD305115 | Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol. |
1 mL syringe | VWR Scientific | BD309659 | For very high value samples, a luer-lok syringe is recommended (e.g. VWR BD309628). |
1-bromo-3-chloropentane (BCP) | Sigma | B9673 | |
For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
RNA purification kit: PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Final steps of RNA preparation. |
DNase/Rnase-free water | Gibco | 10977 | DEPC-treated water can also be used. |
Spectrophotometer: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications. |
Hydrophobic pen | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | PBS for immunofluorescence protocol. |
Donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence. Normal goat serum can also be used. |
eMHC antibody | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
Collagen VI antibody | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
Donkey anti-rabbit AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
Aqueous mounting media: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties. |
Glass coverslip | VWR Scientific | 16004-314 | Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl |
Image analysis software: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express, or more advanced products | Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process. E.g. ImageProPremier. |
Merge and map section images: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated. |
reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used. |
Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system | Promega | M8298 | Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead. |
SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers. |
ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments |
Real-time PCR | Applied Biosystems | 7900HT |