遺伝子発現と組織学的分析のためにシングルマウス骨格筋の連続領域の凍結切片化
Summary
連続凍結切片を、単一のマウス骨格筋からの隣接領域を用いた遺伝子発現の測定のための組織学的応用およびRNAの濃縮を可能にするために収集されます。直接アプリケーション間で比較され、プールされた凍結切片と測定30mgの – 高品質のRNAが20から得られます。
Abstract
この方法では、連続した凍結切片は、単一のマウス骨格筋からの隣接領域を用いて、遺伝子発現のための組織の組織学とRNAの濃縮のための両方の顕微鏡アプリケーションを可能にするために収集されます。典型的には、それがバッファボリュームは、効率的な研削用途には低すぎるかもしれないので、まだ十分な機械的破壊することなく、小さな骨格筋サンプルの適切な均質化を達成するために挑戦され、緩衝剤の筋限界浸透の密集組織構造は、最終的に低いRNA収量を引き起こします。ここで報告されたプロトコルに従うことにより、30μmのセクションでは、収集され、バッファへの浸透のために露出表面積を増加させ、凍結切片およびその後の針均質化が筋肉を混乱させる機械的にできるようにプールしました。技術の主要な制限は、クライオスタットを必要とすることであり、それは比較的低いスループットです。しかし、高品質のRNAをプールし、Mの小さなサンプルから得られますuscle凍結切片は、多くの異なる骨格筋および他の組織のために、この方法は、アクセス可能にします。測定は直接実験的不確実性を低減し、のための小さな組織を供給するのに必要な複製の動物実験を低減するためにアプリケーション間で比較することができるように、また、この技術は、単一の骨格筋の隣接領域からの一致分析（ 例えば、組織の組織病理学および遺伝子発現）を可能にします複数のアプリケーション。
Introduction
この技術の目的は、単一の小さな骨格筋ソース組織からアクセスでき、そのような組織学および遺伝子発現など異なるモダリティ、ことで、複数の実験的な分析を行うことです。顕微鏡アプリケーションを注意深く凍結保存中に氷晶アーチファクトの形成を制限するように制御されなければならないサンプルの保存方法に最も敏感です。したがって、この方法の開発は、部分的に免疫蛍光顕微鏡法および遺伝子発現の両方のための原料物質分析として-140℃の液体窒素冷却2-メチルブタン浴中で樹脂を埋め込んで被覆された凍結前脛骨（TA）筋に基づいています。
多様な技術的アプローチのために同一の原料物質を使用する必要性は、左右の筋肉が異なる条件、実験の1つずつの制御を表す筋肉内注射に基づく実験のために特に重要です。例えば、筋肉再生の研究で一μSCLEは反対側の筋肉がビヒクル注射対照1として機能する広範な組織の損傷を引き起こす毒素を注射します。同様に、筋疾患の遺伝子治療研究は、典型的には、反対側2の空ベクター、無関係ベクターまたはビヒクル対照と比較する筋肉内注射による遺伝子治療ベクターの検証で始まります。したがって、別のアプリケーションに各TA筋を供給することは不可能です。
この問題に対処するための一般的な戦略は次のとおりです。私は）ii）の追加のマウスを使用すること、またはiii）は、各アプリケーションのための筋肉の一部を遮断するために、アプリケーションごとに異なる筋肉群を使用します。しかし、筋群の間に実質的な差異は、それが困難な別個のアプリケーションからのデータを比較することを可能にする、追加の動物は費用を増加させ、他の選択肢が存在する場合、不十分正当化されます。異なるアプリケーションを調達するために解剖した後に筋肉を割ると、最良の選択肢の私ですnは多くの場合。しかし、筋肉片は、しばしば均質2-5のために液体窒素または機械的な粉砕技術の下で粉砕を使用するには小さすぎます。筋肉は、細胞外マトリックス及び収縮タンパク質を充填した高度に構造組織であるため、不十分な機械的な均質化は、その後のDNA、RNAまたはタンパク質の低い収率をもたらします。ここでの詳細な方法は、複数のアプリケーションで使用するための1つのソース筋からの組織の少量を可能にし、凍結切片と針粉砕を含めることは、より良好なRNAの収量のための機械的均質化を向上させます。
Protocol
Representative Results
Discussion
余分な樹脂は、プールされた凍結切片のコレクションが遅くなりますし、RNA単離に樹脂汚染を埋め込む増加させることができるので、この方法で最良の結果を達成するために、組織の凍結保存中に筋肉の下3分の1または半分に制限された樹脂を埋め込む保ちます。また、針の均質化中細心の注意は、収量を最大化し、針を目詰まりの可能性を最小限にすることが重要です。プロトコルは、針?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre and Junna Luan provided technical assistance. Research reported in this publication was supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under award number AR065077. The content is solely the responsibility of the author and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Cork | VWR Scientific | 23420-708 | Cut into small squares with a sharp blade. |
| Plastic coverslip | Fisher Scientific | 12-547 | Used to orient the muscle during freezing. |
| Low temperature thermometer | VWR Scientific | 89370-158 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631-4L | Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet. |
| Embedding resin: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | Other embedding resins can be substituted for cryomatrix. |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 with disposable blade carrier | Any working cryostat should be sufficient for the protocol. |
| Disposable cryostat blade | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used. |
| RNAse decontamination solution: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS64 | |
| Paint brush | Daler Rowney | 214900920 | Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies. |
| Razor blade | VWR Scientific | 55411-050 | |
| Microscope slide | VWR Scientific | 48311600 | |
| RNA organic extraction reagent: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle. |
| 18 gauge needle | VWR Scientific | BD305185 | |
| 22 gauge needle | VWR Scientific | BD305155 | |
| 26 gauge needle | VWR Scientific | BD305115 | Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol. |
| 1 mL syringe | VWR Scientific | BD309659 | For very high value samples, a luer-lok syringe is recommended (e.g. VWR BD309628). |
| 1-bromo-3-chloropentane (BCP) | Sigma | B9673 | |
| For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
| For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
| RNA purification kit: PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Final steps of RNA preparation. |
| DNase/Rnase-free water | Gibco | 10977 | DEPC-treated water can also be used. |
| Spectrophotometer: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications. |
| Hydrophobic pen | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | PBS for immunofluorescence protocol. |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence. Normal goat serum can also be used. |
| eMHC antibody | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
| Collagen VI antibody | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
| Donkey anti-rabbit AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Aqueous mounting media: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties. |
| Glass coverslip | VWR Scientific | 16004-314 | Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl |
| Image analysis software: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express, or more advanced products | Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process. E.g. ImageProPremier. |
| Merge and map section images: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated. |
| reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used. |
| Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system | Promega | M8298 | Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead. |
| SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers. |
| ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments |
| Real-time PCR | Applied Biosystems | 7900HT |
Riferimenti
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