Cryosectioning соприкасающихся регионов скелетной мышцы одной мыши для экспрессии генов и гистологических анализов
Summary
Последовательные криопроводники секции собираются для того, чтобы гистологические приложений и обогащение РНК для измерения экспрессии генов с использованием соседних областей от одной мыши скелетных мышц. Высококачественная РНК получают из 20 – 30 мг объединенных криосрезах и измерений непосредственно сопоставлены между приложениями.
Abstract
С помощью этого метода последовательных криосрезы собираются для того, чтобы обе микроскопии приложений для гистологического исследования тканей и обогащения РНК для экспрессии генов с использованием соседних регионов от одной мыши скелетных мышц. Как правило, это является сложной задачей для достижения адекватного гомогенизации небольших образцов скелетных мышц, поскольку объемы буфера может быть слишком низкой для эффективного применения шлифования, но без достаточного механического разрушения, архитектура плотной ткани ограничивает мышцы проникновения буферных реагентов, в конечном счете вызывает низкий выход РНК. Следуя протоколу, которые сообщаются здесь, 30 мкм срезы собирают и объединяют позволяя cryosectioning и последующее игла гомогенизация, чтобы механически разрушить мышцы, увеличивая площадь поверхности, обнаженную для проникновения буфера. Основные недостатки метода является то, что она требует криостат, и она является относительно низкой пропускной способностью. Тем не менее, высокого качества РНК могут быть получены из небольших образцов объединенном мuscle криосрезы, что делает этот метод доступным для многих различных скелетных мышц и других тканей. Кроме того, этот метод позволяет совпадающая анализы (например, гистопатологии ткани и экспрессии генов) из смежных областей одной скелетной мышцы так , чтобы измерения можно непосредственно сравнивать между приложениями для уменьшения экспериментальной погрешности и для снижения репликативные экспериментов на животных необходимо источник небольшую ткань для несколько приложений.
Introduction
Целью данной методики является сделать несколько экспериментальных анализов с помощью различных методов, таких как выражение гистологии и генов, доступных из одного небольшого скелета источника мышечной ткани. Микроскопия приложения являются наиболее чувствительными к образцу методов сохранения, которые необходимо тщательно контролировать, чтобы ограничить образование кристаллов льда артефактов во время криоконсервации. Таким образом, развитие метод основан на передней большеберцовой (TA) мышца замороженные частично покрыта встраивание смолы в охлаждаемой жидким азотом 2-метилбутан ванны -140 ° С в качестве исходного материала для обоих иммунофлюоресценции микроскопии и анализа экспрессии генов.
Необходимость использовать один и тот же исходный материал для различных технических подходов особенно важно для внутримышечных инъекций экспериментов на основе которых левые и правые мышцы представляют различные условия, одно экспериментальное и один элемент управления. Например, в исследованиях регенерации мышц, один мюSCLE вводят токсин , чтобы вызвать повреждение тканей широко распространенное в то время как контралатеральной мышца служит в качестве транспортного средства с впрыском контроля 1. Точно так же исследования генной терапии для мышечных нарушений , как правило , начинают с проверки вектора генной терапии путем внутримышечной инъекции в сравнении с пустым вектором, не связанного вектора или управления транспортным средством на контралатеральной стороне 2. Таким образом, не представляется возможным источником каждой ТП мышцы на другое приложение.
Общие стратегии борьбы с этой проблемой являются: я), чтобы использовать другую группу мышц для каждого приложения, б) использовать дополнительные мышей, или III), чтобы отрезать кусок мышцы для каждого приложения. Тем не менее, существенные различия между группами мышц затрудняют сравнение данных из отдельных приложений, а также дополнительные животные увеличивают расход и плохо обоснованным, если существуют другие альтернативы. Разделив мышцы после рассечения на источник различных приложений является наилучшим вариантом яп много случаев. Тем не менее, мышечные части часто слишком малы , чтобы использовать размельчение под жидким азотом или механическим методам заточной для гомогенизации 2-5. Как мышца является высокоэффективным структурным ткани упакованы с внеклеточным матриксом и сократительных белков, неадекватной механической гомогенизации приводит к низкому выходу последующей ДНК, РНК или белка. Подробно здесь метод позволяет небольшое количество ткани от одного источника мышцы для использования в различных приложениях, а также включение cryosectioning и иглы растирание улучшает механическую гомогенизацию для лучшего выхода РНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для достижения наилучших результатов с помощью этого метода, сохранить вложение смолы, ограниченного нижней трети или половине мышцы во время криоконсервации ткани, потому что избыток смолы замедлит коллекцию объединенных криосрезах и может увеличить вложение загрязнения смолы в из…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre and Junna Luan provided technical assistance. Research reported in this publication was supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under award number AR065077. The content is solely the responsibility of the author and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Cork | VWR Scientific | 23420-708 | Cut into small squares with a sharp blade. |
| Plastic coverslip | Fisher Scientific | 12-547 | Used to orient the muscle during freezing. |
| Low temperature thermometer | VWR Scientific | 89370-158 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631-4L | Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet. |
| Embedding resin: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | Other embedding resins can be substituted for cryomatrix. |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 with disposable blade carrier | Any working cryostat should be sufficient for the protocol. |
| Disposable cryostat blade | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used. |
| RNAse decontamination solution: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS64 | |
| Paint brush | Daler Rowney | 214900920 | Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies. |
| Razor blade | VWR Scientific | 55411-050 | |
| Microscope slide | VWR Scientific | 48311600 | |
| RNA organic extraction reagent: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle. |
| 18 gauge needle | VWR Scientific | BD305185 | |
| 22 gauge needle | VWR Scientific | BD305155 | |
| 26 gauge needle | VWR Scientific | BD305115 | Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol. |
| 1 mL syringe | VWR Scientific | BD309659 | For very high value samples, a luer-lok syringe is recommended (e.g. VWR BD309628). |
| 1-bromo-3-chloropentane (BCP) | Sigma | B9673 | |
| For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
| For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
| RNA purification kit: PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Final steps of RNA preparation. |
| DNase/Rnase-free water | Gibco | 10977 | DEPC-treated water can also be used. |
| Spectrophotometer: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications. |
| Hydrophobic pen | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | PBS for immunofluorescence protocol. |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence. Normal goat serum can also be used. |
| eMHC antibody | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
| Collagen VI antibody | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
| Donkey anti-rabbit AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Aqueous mounting media: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties. |
| Glass coverslip | VWR Scientific | 16004-314 | Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl |
| Image analysis software: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express, or more advanced products | Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process. E.g. ImageProPremier. |
| Merge and map section images: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated. |
| reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used. |
| Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system | Promega | M8298 | Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead. |
| SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers. |
| ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments |
| Real-time PCR | Applied Biosystems | 7900HT |
Riferimenti
- Foltz, S. J., et al. Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice. PLoS One. 11 (1), 0147049 (2016).
- Bartoli, M., et al. Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies. Gene Ther. 13, 20-28 (2006).
- Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies. Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).
- Beedle, A. M., et al. Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy. J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).
- Foltz, S. J., et al. Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy. Skeletal Muscle. 6, 20 (2016).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).
- Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells. BMC Res. Notes. 3, 211 (2010).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).
- Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4. Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).
- Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4. Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).
- Chomczynski, P., Mackey, K. Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation. Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).
- Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation. J. Biol. Methods. 2 (2), 20 (2015).
- Guo, D., Catchpoole, D. R. Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue. BioTechniques. 34, 48-50 (2003).
- Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining. J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).
- Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis. Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).
- Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
