Konsekutiva Cryo-sektioner samlas in för att göra det möjligt för histologiska applikationer och anrikning av RNA för genuttryck mätningar med angränsande regioner från en enda mus skelettmuskel. Hög kvalitet RNA erhålls från 20 – 30 mg poolade kryosnitt och mätningar direkt jämföras mellan program.
Med den här metoden är konsekutiva kryosnitt samlas in för att göra det möjligt för både mikroskopi applikationer för vävnads histologi och anrikning av RNA för genuttryck med hjälp av angränsande regioner från en enda mus skelettmuskel. Normalt är det en utmaning att uppnå adekvat homogenisering av små skelettmuskelprover eftersom buffertvolymer kan vara för låg för effektiva sliptillämpningar, men utan tillräcklig mekanisk störning, den täta vävnad arkitektur muskel gränser penetration av buffertreagens, slutligen orsakar låg RNA avkastning. Genom att följa det protokoll som rapporteras här, är 30 | j, m sektioner uppsamlades och slogs samman vilket gör cryosectioning och efterföljande nål homogenisering för att mekaniskt störa muskeln, vilket ökar den yta som utsätts för buffert penetration. De primära begränsningarna i tekniken är att den kräver en kryostat, och det är relativt låg genomströmning. Däremot kan hög kvalitet RNA erhållas från små prover av poolade muscle kryosnitt, vilket gör denna metod tillgänglig för många olika skelettmuskler och andra vävnader. Dessutom möjliggör denna teknik matchade analyser (t.ex. vävnad histopatologi och genuttryck) från intilliggande regioner i en enda skelettmuskel så att mätningar kan direkt jämföras mellan program för att minska experimentell osäkerhet och att minska replikations djurförsök nödvändigt att köpa en liten vävnad för flera applikationer.
Målet med denna teknik är att göra flera experimentella analyser av olika metoder, såsom histologi och genuttryck, tillgänglig från en enda liten skelettmuskulatur källvävnaden. Mikroskopi applikationer är mest känsliga för prov konserveringsmetoder, som måste kontrolleras noggrant för att begränsa bildandet av iskristall artefakter under frysförvaring. Således är metodutveckling baserad på tibialis anterior (TA) muskel frysta delvis täckt med inbäddning harts i en -140 ° C flytande kväve kyld 2-metylbutan bad som källmaterial för både immunofluorescensmikroskopi och genuttryck analyser.
Behovet av att använda samma källmaterial för olika tekniska tillvägagångssätt är särskilt viktigt för injektionsbaserade intramuskulära experiment där vänster och höger muskler representerar olika villkor, en experimentell och en kontroll. Till exempel i muskelregenereringsstudier, en muscle injiceras med ett toxin för att orsaka omfattande vävnadsskada, medan det kontralaterala muskeln fungerar som en fordons injicerad kontroll 1. På samma sätt, genterapistudier för muskelsjukdomar börjar vanligtvis med validering av genterapivektor genom intramuskulär injektion att jämföras med tom vektor, orelaterade vektor eller vehikelkontroll på den kontralaterala sidan 2. Därför är det inte möjligt att köpa varje TA muskler till ett annat program.
Gemensamma strategier för att ta itu med denna fråga är: i) att använda en annan muskelgrupp för varje applikation, ii) att använda ytterligare möss, eller iii) att skära av en bit av muskeln för varje applikation. Men betydande skillnader mellan muskelgrupper gör det svårt att jämföra data från olika applikationer, och ytterligare djur ökar kostnader och är dåligt motiverade om andra alternativ finns. Dela muskeln efter dissektion att köpa olika applikationer är det bästa alternativet in många fall. Men muskel bitar är ofta för små för att använda pulvrisering under flytande kväve eller mekaniska sliptekniker för homogenisering 2-5. Muskel är en mycket strukturell vävnad packad med extracellulära matrix och sammandragande proteiner leder otillräcklig mekanisk homogenisering till ett lågt utbyte av efterföljande DNA, RNA eller protein. Metoden beskrivs här gör att små mängder av vävnad från en källa muskel för användning i flera tillämpningar, och införandet av cryosectioning och nål triturering förbättrar mekanisk homogenisering för bättre RNA avkastning.
För att uppnå bästa resultat med denna metod, hålla bädda harts begränsas till den nedre tredjedel eller hälften av muskeln under vävnadsfrysförvaring, eftersom överskott av harts kommer att bromsa insamlingen av poolade kryosnitt och kan öka bädda föroreningar harts i RNA-isolering. Dessutom är noggrann uppmärksamhet under nålen homogenisering viktigt att maximera avkastningen och minska risken för igensättning av nålen. Protokollet kan modifieras genom användning av en Luer-Lok spruta för att skyd…
The authors have nothing to disclose.
Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre and Junna Luan provided technical assistance. Research reported in this publication was supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under award number AR065077. The content is solely the responsibility of the author and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Cork | VWR Scientific | 23420-708 | Cut into small squares with a sharp blade. |
Plastic coverslip | Fisher Scientific | 12-547 | Used to orient the muscle during freezing. |
Low temperature thermometer | VWR Scientific | 89370-158 | |
2-methylbutane | Sigma | M32631-4L | Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet. |
Embedding resin: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | Other embedding resins can be substituted for cryomatrix. |
Cryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 with disposable blade carrier | Any working cryostat should be sufficient for the protocol. |
Disposable cryostat blade | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used. |
RNAse decontamination solution: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
Analytical balance | Mettler Toledo | XS64 | |
Paint brush | Daler Rowney | 214900920 | Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies. |
Razor blade | VWR Scientific | 55411-050 | |
Microscope slide | VWR Scientific | 48311600 | |
RNA organic extraction reagent: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle. |
18 gauge needle | VWR Scientific | BD305185 | |
22 gauge needle | VWR Scientific | BD305155 | |
26 gauge needle | VWR Scientific | BD305115 | Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol. |
1 mL syringe | VWR Scientific | BD309659 | For very high value samples, a luer-lok syringe is recommended (e.g. VWR BD309628). |
1-bromo-3-chloropentane (BCP) | Sigma | B9673 | |
For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
RNA purification kit: PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Final steps of RNA preparation. |
DNase/Rnase-free water | Gibco | 10977 | DEPC-treated water can also be used. |
Spectrophotometer: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications. |
Hydrophobic pen | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | PBS for immunofluorescence protocol. |
Donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence. Normal goat serum can also be used. |
eMHC antibody | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
Collagen VI antibody | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
Donkey anti-rabbit AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
Aqueous mounting media: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties. |
Glass coverslip | VWR Scientific | 16004-314 | Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl |
Image analysis software: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express, or more advanced products | Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process. E.g. ImageProPremier. |
Merge and map section images: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated. |
reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used. |
Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system | Promega | M8298 | Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead. |
SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers. |
ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments |
Real-time PCR | Applied Biosystems | 7900HT |