صالحة يجند نانو الكتلة في الدهن طبقة ثنائية المعتمدة
Summary
نقدم بروتوكول لfunctionalize الزجاج مع بقع البروتين النانومترية تحيط بها طبقة ثنائية الدهن السائل. هذه ركائز متوافقة مع المجهر الضوئي المتقدمة، ومن المتوقع أن تكون بمثابة منصة للدراسات التصاق الخلايا والهجرة.
Abstract
حاليا هناك اهتماما كبيرا في خلق صفائف أمر من الجزر البروتين لاصقة في بحر من سطح تخميلها للدراسات البيولوجية الخلية. في السنوات الماضية، فقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن الخلايا الحية تستجيب، وليس فقط لطبيعة البيوكيميائية من الجزيئات المقدمة لهم ولكن أيضا على الطريقة التي يتم بها عرض هذه الجزيئات. خلق البروتين أنماط الصغرى ولذلك المعيار الآن في العديد من المختبرات البيولوجية. متعدد الأنماط نانو هي أيضا أكثر سهولة. ومع ذلك، في سياق التفاعلات خلية خلية، هناك حاجة إلى نمط ليس فقط ولكن أيضا البروتينات طبقات ثنائية الدهون. وحتى الآن لم تكن هذه المزدوجة الزخرفة-PROTEO شحمي الوصول إليها بسهولة. نحن نقدم تقنية السطحية لخلق البروتين نانو النقاط معتمدة على الزجاج واقتراح طريقة لردم مساحة بين نقطة مع طبقة ثنائية الدهون المدعومة (SLB). من الصور تبييض التتبع الدهون الفلورسنت المدرجة في SLB، علينا أن نبرهن على طبقة ثنائية المعارض الكبيرة في وررسيولة انو. Functionalizing النقاط البروتين مع مجموعات الفلورسنت يسمح لنا صورة لها وتظهر أنها تنظم في شعرية سداسية منتظمة. النقطة حجم النموذجي هو حوالي 800 نانومتر، والتباعد تظاهر هنا هو 2 ميكرون. ويتوقع لهذه ركائز لخدمة منصات مفيدة لالتصاق الخلايا والهجرة والدراسات والميكانيكية الاستشعار عن بعد.
Introduction
التصاق الخلايا تتم من خلال جزيئات متخصصة التصاق الخلية (الحدب)، البروتينات الموجودة على غشاء الخلية التي هي قادرة على الربط إلى نظيرتها في نسيج خارج الخلية أو على خلية أخرى. على خلايا الالتزام، ومعظم جزيئات الالتصاق بما في ذلك إنتغرين في كل مكان وكادهيرين، وتوجد في شكل مجموعات 1. تفاعل الخلايا الليمفاوية T (خلايا T) مع خلايا مقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة) يوفر التوضيح ولا سيما ضرب من أهمية مجموعات مستقبلات شكلت في واجهة بين خليتين – غالبا ما يسمى المشبك المناعي. على تشكيل أول اتصال مع مستقبلات الخلايا APC، T (TCRs) على سطح T شكل خلية ميكرون مجموعات على نطاق والتي تكون بمثابة إشارات منصات 2، 3، 4، ومركزية في نهاية المطاف إلى تشكيل أكبر كتلة supramolecular المركزية (cSMAC )معشوقة = "XREF"> 5، 6، 7. مؤخرا، تبين أن على الجانب APC، وتتركز في بروابط من TCR أيضا 8.
في سياق T خلية APC التفاعل، ونشر الأنظمة الهجينة، حيث حاكت APC قبل العشب الصناعي functionalized مع البروتينات ذات الصلة، وقد تقدمت كثيرا فهمنا واجهة متشابك 2، 3، 4، 5، 6، 7 . في هذا السياق، هو ذات أهمية كبيرة لتصميم APC السطوح المحاكاة التي تستحوذ واحد أو أكثر من جوانب الخلية المستهدفة. على سبيل المثال، إذا تم المطعمة بروابط على طبقات ثنائية الدهون المعتمدة، فإنها يمكن أن تنتشر في الطائرة من طبقة ثنائية، تحاكي الوضع على سطح APC، وفي الوقت نفسه تسمح تشكيلcSMAC 6 و 7. وبالمثل، وقد حاكت مجموعات على APC من خلال خلق جزر بروابط في بحر من البوليمرات 9، 10، 11، 12، 13، 14. ومع ذلك، حتى الآن لم يتم الجمع بين هذه الميزات اثنين.
نحن هنا وصف تقنية الرواية لخلق نانو النقاط مكافحة CD3 (الأجسام المضادة التي تستهدف مجمع TCR) وتحيط بها طبقة ثنائية الدهون مع الدهون نشرها. وتودع طبقة ثنائية باستخدام انجمير-بلودجيت / انجمير-شايفر تقنية 7 و 15 و 16 و إذا رغبت في ذلك، يمكن functionalized مع بروتين معين – على سبيل المثال، يجند للخلية إنتغرين T (وتسمى ICAM1). وبالإضافة إلى ذلك، ومكافحة CD3 النقاط البروتين فصول التوجيه الجامعييتم استبدال دينار مع الأجسام المضادة أو CAM آخر. في حين أننا اخترنا البروتينات لاستخدامها في المستقبل كمنصة لT الدراسات التصاق الخلية، واستراتيجية مفصلة هنا يمكن تكييفها لأي البروتين، وحتى الحمض النووي.
Protocol
Representative Results
Discussion
ترتبط الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول المذكورة أعلاه إلى تشكيل البروتين نانو النقاط أو العودة ملء الفضاء حول النقاط التي كتبها طبقة ثنائية الدهون المعتمدة. الخطوة الأولى الحاسمة فيما يتعلق البروتين نانو النقاط هي إعداد حبة قناع. تنظيف غطاء الشريحة أمر بالغ الأهمية. وي…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر لوران Limozin، بيير ديلارد واستريد فاهل لمواصلة مناقشات مثمرة حول التطبيقات الخلوية. كما نشكر فريدريك البدو من مرفق غرف الأبحاث PLANETE لمساعدته مع الملاحظات SEM. وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مجلس البحوث الأوروبي عبر منحة رقم 307104 FP / 2007-2013 / ERC.
Materials
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | |
| Observation chamber | Home made | |
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | |
| Desiccator | Labbox | |
| Crystallizer | Shott | |
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | |
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 |
| Film balance | NIMA | Medium |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | |
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
Riferimenti
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2002).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
- Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
- Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
- Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
- Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
- Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
- Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
- Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
- Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
- Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
- Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
- Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
- Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
- Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
- Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
- Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
- Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
- Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
- Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
- Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398 (2012).
- Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).
