Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler
Summary
Biz bir sıvı lipid iki katmanının çevrili nanometrik protein yamaları ile cam fonksiyonel hale getirilmesi için bir protokol mevcut. Bu alt tabakalar gelişmiş optik mikroskop ile uyumludur ve hücre yapışması ve göç çalışmaları için platform olarak hizmet etmesi beklenmektedir.
Abstract
Şu anda hücre biyolojik çalışmalar için pasifize yüzeyinin denizinde yapışkan proteini adaların sıralı dizi oluşturulurken önemli bir ilgi vardır. Geçmiş yıllarda, bu canlı hücreler kendilerine sunulan moleküllerin biyokimyasal doğaya hem de bu moleküller sunulmaktadır yolu değil, tepki giderek daha açık hale gelmiştir. Birçok biyoloji laboratuvarlarında artık standart nedenle protein mikro desenleri olan oluşturma; Nano-desenler de daha erişilebilir. Bununla birlikte, hücre-hücre etkileşimleri bağlamında, desene bir ihtiyaç sadece proteinleri değil, aynı zamanda, lipid ikili tabakaları vardır. Böyle ikili proteo-lipit desenleme şimdiye kadar kolayca erişilebilir olmamıştır. Biz cam üzerinde desteklenen bir protein nano nokta oluşturmak ve desteklenen bir lipit çift katman (SLB) ile arası nokta alanı doldurmak için genellikle bir yöntem önermektir, basit bir teknik sunar. izleyici foto-ağartma itibaren floresan lipidleri SLB dahil, biz iki tabakalı in-pl hatırı sayılır gösterdiğini kanıtlarane akışkanlığı. floresan gruplarla protein noktalar fonksiyonlandırmak görüntünün onları ve düzenli bir altıgen kafes içinde sıralanır olduğunu göstermek için bize izin verir. Tipik nokta boyutu yaklaşık 800 nm'dir ve burada gösterilen aralık 2 mikrondur. Bu alt-tabakalar, hücre yapışması, göç ve mekano-algılama çalışmaları için yararlı platformlar hizmet etmesi beklenmektedir.
Introduction
Hücre yapışması, hücre dışı matris üzerinde veya başka bir hücre üzerinde kendi meslektaşı bağlanabilen olan hücre zarı üzerinde mevcut olan özel hücre yapışma molekülleri (CAMlar) proteinleri aracılığıyla gerçekleşir. Yapışan hücreler üzerinde, her yerde integrin ve cadherin dahil olmak üzere en yapışma molekülleri, kümelerin 1 şeklinde bulunurlar. Antijen sunan hücreler ile T lenfositler (T hücreleri) etkileşmesi (APC) iki hücre arasındaki ara yüzeyde oluşan reseptör kümelerinin önemi özellikle çarpıcı bir örnek teşkil etmektedir – genellikle bir immünolojik sinaps adı. CSMAC (daha büyük bir orta moleküllü bir küme oluşturmak için platformlar 2, 3, 4 sinyal olarak görev yapar ve en sonunda merkezi T hücresi formu mikron çaplı kümelerinin yüzeye APC T hücre reseptörleri (TCR'ler) ile ilk temas oluşturan üzerine )lass = "xref"> 5, 6, 7. Son zamanlarda, bu APC tarafında gösterilmiştir, TCR'nin ligandların da 8 kümelenir.
APC ilgili protein ile fonksiyonel bir yapay yüzeyi tarafından taklit edilir T hücre-APC etkileşiminin, hibrid sistem dağıtım, bağlamında, sinaptik arayüzü 2, 3, 4, 5, 6, 7 anlaşılmasını büyük olan . Bu bağlamda, hedef hücrenin bir veya daha fazla yönlerini yakalamak APC mimetik yüzeyleri tasarlamak için son derece önemlidir. ligandlar desteklenen lipid çift tabakaları aşılanmış Örneğin, bunlar, çift-katlı düzleminde difüze APC yüzeyi üzerinde durumu taklit ve aynı zamanda oluşmasına izin verebilircSMAC 6, 7. Benzer bir şekilde, APC üzerinde kümeleri polimerler 9, 10, 11, 12, 13, 14 bir denizde ligandların yaratırlar tarafından taklit edilmiştir. Ancak, bu iki özellik şu ana kadar kombine edilmemiştir.
Burada difüzyon lipidler ile bir lipit çift katmanı ile çevrelenir, anti-CD3 (TCR kompleksinin hedefleyen bir antikor) nano-noktaları oluşturmak için yeni bir teknik açıklanmaktadır. Iki tabakalı Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schaefer tekniği 7, 15, 16 kullanılarak yatırılır ve eğer arzu edilirse, belirli bir protein ile işlevselleştirilebilir – örneğin, T hücresi integrin ligandı (ICAM1 olarak adlandırılır). Buna ek olarak, anti-CD3 protein noktalar could başka bir antikor ya da CAM ile değiştirilebilir. T hücre yapışma çalışmaları için platform olarak ileride kullanılmak üzere proteinler seçilmiş olmakla birlikte, burada açıklanan bir strateji herhangi bir protein ve hatta DNA için uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıda tarif edilen protokol içindeki kritik adım desteklenen bir lipit çift katman protein nano nokta veya noktalar çevresindeki alan arka-dolgu oluşumu ile ilişkilidir. Protein nano nokta ile ilgili olarak, ilk kritik bir adım boncuk maske hazırlanmasıdır. kapak slayt temizleme kritiktir. Slaytlar, ya da oksijen plazma ile kuartz küvetler temizlenmesi için önerilen bir deterjan çözeltisi ile temizlenmesi gerekir. etanol ya da izo-propanol tedavisinde daldırma gibi diğer temizleme teknikleri yeterin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz hücresel uygulamalar hakkında verimli tartışmalar devam için Laurent Limozin Pierre Dillard ve Astrid Wahl teşekkür ederim. Ayrıca SEM gözlemleri ile yaptığı yardım için PLANETE temiz oda tesisinden Frederic Bedu teşekkür ederim. Bu çalışma kısmen hibe sayılı 307.104 FP / 2007-2013 / ERC yoluyla Avrupa Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi.
Materials
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | |
| Observation chamber | Home made | |
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | |
| Desiccator | Labbox | |
| Crystallizer | Shott | |
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | |
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 |
| Film balance | NIMA | Medium |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | |
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
Riferimenti
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2002).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
- Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
- Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
- Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
- Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
- Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
- Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
- Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
- Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
- Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
- Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
- Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
- Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
- Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
- Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
- Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
- Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
- Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
- Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
- Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398 (2012).
- Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).
