Ligand Nano-kluster arrayer i en stöds lipiddubbelskikt
Summary
Vi presenterar ett protokoll för att funktionalisera glas med nanometriska protein patchar omgivna av en fluid lipiddubbelskikt. Dessa substrat är kompatibla med avancerad optisk mikroskopi och förväntas tjäna som plattform för celladhesion och migration studier.
Abstract
För närvarande finns ett stort intresse för att skapa ordnade arrangemang av adhesiva protein öar i ett hav av passiverad yta för cellbiologiska studier. Under de senaste åren har det blivit allt tydligare att levande celler reagerar, inte bara för den biokemiska naturen hos molekylerna presenteras för dem, men också till hur dessa molekyler presenteras. Skapa proteinmikromönster är därför nu standard i många biologiska laboratorier; nano mönster är också mer tillgänglig. Men i samband med cell-cell interaktioner, finns det ett behov av att mönstret inte bara proteiner utan också lipidbiskikt. En sådan dubbel Proteo-lipidiska mönstring har hittills inte varit lättillgänglig. Vi erbjuder en enkel teknik för att skapa proteinnano punkter stöds på glas och föreslå en metod för att återfyllning inter-dot utrymme med en stöds lipidbiskikt (SLB). Från fotoblekning av spårämne fluorescerande lipider som ingår i SLB, visar vi att biskiktet uppvisar betydande in-plane fluiditet. Funktionalisering av protein prickar med fluorescerande grupper tillåter oss att bilden dem och visa att de är ordnade i en regelbunden hexagonal gitter. Den typiska punktstorlek är ungefär 800 nm och avståndet visat här är 2 mikron. Dessa substrat förväntas fungera som användbara plattformar för celladhesion, migrering och mekaniskt-avkännande studier.
Introduction
Celladhesion sker genom specialiserade celladhesionsmolekyler (CAMs), proteiner som är närvarande på cellmembranet som är kapabla att binda till sin motsvarighet på extracellulär matrix eller på en annan cell. På vidhäftade celler, de flesta adhesionsmolekyler inklusive den allestädes närvarande grin och kadherin, återfinns i form av kluster 1. Interaktionen av T-lymfocyter (T-celler) med antigenpresenterande celler (APC: er) ger en särskilt slående illustration av betydelsen av receptor kluster som bildas vid gränsytan mellan de två cellerna – ofta kallas en immunologisk synaps. Vid bildande den första kontakten med de cellreceptorer (TCR) på ytan av de cellformen mikronskala kluster T som fungerar som signaleringsplattformar 2, 3, 4, och slutligen centraliserad APC, T för att bilda en större central supramolekylär kluster (cSMAC )lass = "xref"> 5, 6, 7. Nyligen visades det att på APC sidan, är liganderna enligt TCR också klustrade 8.
I samband med T-cell-APC-interaktion, utplaceringen av hybridsystem, där APC imiteras av en artificiell yta funktionaliserad med relevanta proteiner, har i hög grad avancerat vår förståelse av den synaptiska gränssnittet 2, 3, 4, 5, 6, 7 . I detta sammanhang är det i högsta grad relevant att utforma APC mimetiska ytor som fångar en eller flera aspekter av målcellen. Till exempel om ligander är ympade på stödda lipidbiskikt, kan de diffundera i planet av dubbelskiktet, efterlikna situationen på APC-ytan och på samma gång tillåta bildandet av dencSMAC 6, 7. På liknande sätt har de kluster på APC varit efterliknas genom att skapa öar av ligander i ett hav av polymerer 9, 10, 11, 12, 13, 14. Men dessa två funktioner har hittills inte kombineras.
Här beskriver vi en ny teknik för att skapa nano prickar av anti-CD3 (en antikropp som riktar sig mot TCR-komplexet) omgiven av ett lipidbiskikt med diffuserande lipider. Dubbelskiktet är avsatt med användning av Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schaefer teknik 7, 15, 16 och om så önskas, skulle kunna funktionaliseras med ett specifikt protein – till exempel liganden av cellen grin T (som kallas ICAM-1). Dessutom, de anti-CD3-protein prickar could ersättas med en annan antikropp eller CAM. Medan vi har valt proteiner för framtida användning som plattform för T-cellvidhäftningsstudier, kan den strategi som beskrivs här anpassas för något protein och även DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritiska stegen inom det protokoll som beskrivs ovan är relaterade till bildningen av proteinnano punkter eller back-fyllning av utrymmet runt prickarna med en uppburen lipiddubbelskikt. Det första kritiska steget med avseende på proteinnano prickar är framställningen av vulsten-masken. Rengöringen av cover-slide är kritisk. Objektglasen måste antingen rengöras med en rengöringslösning som rekommenderas för rengöring kvartskyvetter, eller med syrgasplasma. Andra rengöringstekniker såsom nedsänkning i …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Laurent Limozin, Pierre Dillard och Astrid Wahl för fortsatt givande diskussioner om cellulära applikationer. Vi vill också tacka Frederic Bedu från PLANETE renrum anläggning för hans hjälp med SEM observationer. Detta arbete har delvis finansierats av Europeiska forskningsrådet via bidrag nr 307.104 FP / 2007-2013 / ERC.
Materials
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | |
| Observation chamber | Home made | |
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | |
| Desiccator | Labbox | |
| Crystallizer | Shott | |
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | |
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 |
| Film balance | NIMA | Medium |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | |
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
Riferimenti
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2002).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
- Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
- Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
- Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
- Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
- Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
- Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
- Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
- Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
- Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
- Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
- Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
- Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
- Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
- Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
- Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
- Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
- Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
- Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
- Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398 (2012).
- Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).
