Shunt Chirurgie, Right hartkatheterisatie, en Vasculaire Morphometry in een diermodel voor Flow-geïnduceerde pulmonale arteriële hypertensie
Summary
This protocol describes a surgical procedure to create a model for flow-induced pulmonary arterial hypertension (PAH) in rats and the procedures to analyze the principle hemodynamic and histological end-points in this model.
Abstract
In this protocol, PAH is induced by combining a 60 mg/kg monocrotalin (MCT) injection with increased pulmonary blood flow through an aorto-caval shunt (MCT+Flow). The shunt is created by inserting an 18-G needle from the abdominal aorta into the adjacent caval vein. Increased pulmonary flow has been demonstrated as an essential trigger for a severe form of PAH with distinct phases of disease progression, characterized by early medial hypertrophy followed by neointimal lesions and the progressive occlusion of the small pulmonary vessels. To measure the right heart and pulmonary hemodynamics in this model, right heart catheterization is performed by inserting a rigid cannula containing a flexible ball-tip catheter via the right jugular vein into the right ventricle. The catheter is then advanced into the main and the more distal pulmonary arteries. The histopathology of the pulmonary vasculature is assessed qualitatively, by scoring the pre- and intra-acinar vessels on the degree of muscularization and the presence of a neointima, and quantitatively, by measuring the wall thickness, the wall-lumen ratios, and the occlusion score.
Introduction
Het doel van deze methode is om een reproduceerbaar model voor ernstige stromingsgeïnduceerde pulmonale arteriële hypertensie in ratten maken en dat in beginsel hemodynamische en histopathologische eindpunten meten.
Pulmonale arteriële hypertensie (PAH) is een klinisch syndroom dat een geleidelijke verhoging van de pulmonale vasculaire weerstand leidt tot rechter ventrikel falen en dood omvat. Binnen het overkoepelende ziektespectrum van pulmonaire hypertensieve ziekten (PH), PAH is de ernstigste vorm en die zonder behandeling 1 blijft. De onderliggende arteriopathie in PAH wordt gekenmerkt door een typische vorm van vasculaire hermodellering dat het vatlumen afsluit. Muscularisatie van normale niet-gemusculariseerd schepen en hypertrofie van de mediale lagen vat worden beschouwd reeds ziekteverschijnselen in PAH ook gezien in andere vormen van PH 2 en 3 worden gedacht omkeerbaar zijn. Als PAH eendvances, de intima-laag begint te verbouwen, uiteindelijk de vorming van karakteristieke neointima laesies 2. Nieuwe intima-type vasculaire longremodellering is exclusief voor PAH en wordt momenteel beschouwd onomkeerbaar 4 te zijn.
Als PAH is een zeldzame ziekte, de vooruitgang in de pathobiological begrip en de ontwikkeling van nieuwe therapieën hebben zwaar op diermodellen ingeroepen. De monocrotalin (MCT) model in ratten een single hit model is, en nog steeds vaak gebruikt. MCT is een toxine dat de schade toebrengt aan de pulmonale arteriolen en regionale ontsteking 5. 60 mg / kg MCT leidt tot een verhoging van de gemiddelde pulmonale arteriële druk (mPAP), pulmonale vasculaire weerstand (PVR) en rechterventrikelhypertrofie (RVH) na 3-4 weken 6. De histomorphology wordt gekenmerkt door geïsoleerde mediale hypertrofie zonder neointima laesies 5. de MCTrattenmodel vormt derhalve een matige vorm van PH en niet PAK, hoewel het gewoonlijk wordt voorgesteld als de laatste.
Bij kinderen met PAH geassocieerd met congenitale links naar rechts shunt (PAH-CHD), verhoogde pulmonaire bloedstroom wordt beschouwd als de essentiële trigger voor de ontwikkeling van neointima laesies 7, 8, 9. Bij ratten kunnen verhoogde pulmonaire bloedstroom worden geïnduceerd door het creëren van een shunt tussen de abdominale aorta en vena cava, een techniek die het eerst beschreven in 1990 10. Alternatieven voor verhoogde pulmonale stroom te creëren zijn door eenzijdige pneumonectomie of subclavia naar longslagader anastomose 11. Conceptuele nadelen van deze modellen bestaan potentiële compenserende groei van de overgebleven long en adaptieve pathway activatie geïnduceerd door de pneumonectomie of iatrogene schade van de pulmonaire vasculatuur te wijtenom longslagader anastomose, zowel verstorende effecten van de toegenomen pulmonale bloedstroom.
Wanneer een aorto- cavale shunt gecreëerd en verhoogde pulmonale bloedstroom wordt geïnduceerd als tweede hit in MCT behandelde ratten, origineel neointima laesies ontstaan en een ernstige vorm van PAH en bijbehorende rechterkamer falen (RVF) ontwikkelen 3 weken na de toegenomen stromen 12. De hemodynamische progressie van PAK's in dit model kan in vivo worden beoordeeld door echocardiografie en rechter hartkatheterisatie. Het vasculaire histomorphology, wanddikte van het drukvat, de mate van arteriolaire occlusie, en parameters voor de rechter ventrikel falen vormen de pijlers van het ex vivo karakterisering van PAH.
Deze methode beschrijft gedetailleerde protocollen voor de aorto-cavale shunt (AC-shunt) chirurgie, rechts hartkatheterisatie, en de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van vasculaire histomorphology.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode beschrijft de chirurgische procedure van een aorto-caval shunt bij ratten voorbehandeld met MCT tot stromingsgeïnduceerde PAK en de technieken om het beginsel van hemodynamische en histopathologische eindpunten dat PAK en dit model te karakteriseren beoordelen creëren.
Kritische stappen in het protocol en problemen oplossen
Chirurgie en na de operatie. Tijdens de aorto- cavale shunt operatie, de meest kritische stap is de dissectie van de aorta en ven…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Netherlands Cardiovascular Research Initiative, the Dutch Heart Foundation, the Dutch Federation of University Medical Centers, the Netherlands Organization for Health Research and Development, and the Royal Netherlands Academy of Sciences (CVON nr. 2012-08, PHAEDRA, The Sebald fund, Stichting Hartekind).
Materials
|
Shunt Surgery |
|||
| Sterile surgical gloves | |||
| Duratears Eye ointment | Alcon | 10380 | |
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Histoacryllic tissue glue | B. Braun Medical | 1050052 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Safil 4-0 sutures violet resorbable | B. Braun Medical | ||
| 18 G needle | Luer | NN1838R BD | tip bent in 45 degrees orifice to the outside |
| Gauzes 10×10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Temgesic Buprenorphine | RB Pharmaceuticals | 5429 | subcutaneous injection |
| Sodium Chloride 0.9 % | |||
| Ventilation mask Rat | |||
| Scalple blade | |||
| Biemer clamp 18 mm, 5 mm opening | AgnTho | 64-562 | |
| Heat mat | |||
| Kocher Clamp | |||
| Shaving machine | |||
| Microscope | Leica | ||
|
Right Heart Catheterization |
|||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile surgical gloves | |||
| Eye ointment | Duratears | ||
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Gauzes 10×10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Needle 20 G | Luer | Tip slightly bent to the inside | |
| Cannula 20 G | Luer | to introduce catheter, tip pre-formed in 20 degrees | |
| Silastic Catheter 15 cm long | 0.5 mm ball 2 mm from tip | ||
| Pressure transducer | Ailtech | ||
| Bedside monitor Cardiocap/5 | Datex-Ohmeda | ||
| Shaving machine | |||
| 10mL Syringe | |||
| Sodium Chloride 0.9 % | for flushing | ||
|
Vascular Morphology |
|||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50ml Syringe | |||
| 4 % Formaldehyde | |||
| 18 G cannula with tube | |||
| Verhoef staining kit | Sigma-Aldrich | HT254 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US |
| Digital slide scanner | Hamamatsu | C9600 | |
| Image-J | |||
| Elastic (Connective Tissue Stain) | Abcam | ab150667 | http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html |
| http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf |
Riferimenti
- Hoeper, M. M., Bogaard, H. J., Condliffe, R., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. J Am Coll Cardiol. 62, D42-D50 (2013).
- Stacher, E., Graham, B. B., Hunt, J. M., et al. Modern age pathology of pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 186 (3), 261-272 (2012).
- Levy, M., Maurey, C., Celermajer, D. S., et al. Impaired apoptosis of pulmonary endothelial cells is associated with intimal proliferation and irreversibility of pulmonary hypertension in congenital heart disease. J Am Coll Cardiol. 49 (7), 803-810 (2007).
- Sakao, S., Tatsumi, K., Voelkel, N. F. Reversible or irreversible remodeling in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 629-634 (2010).
- Gomez-Arroyo, J. G., Farkas, L., Alhussaini, A. A., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (4), L363-L369 (2012).
- Jones, J. E. Serial noninvasive assessment of progressive pulmonary hypertension in a rat model. Am J Physiol – Heart Circ Physiol. 283 (1), 364-371 (2002).
- Hoffman, J. I., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Pulmonary vascular disease with congenital heart lesions: Pathologic features and causes. Circulation. 64 (5), 873-877 (1981).
- van Albada, M. E., Berger, R. M. Pulmonary arterial hypertension in congenital cardiac disease–the need for refinement of the evian-venice classification. Cardiol Young. 18 (1), 10-17 (2008).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A., Berger, R. M. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: Lessons from preclinical animal models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Garcia, R., Diebold, S. Simple, rapid, and effective method of producing aortocaval shunts in the rat. Cardiovasc Res. 24 (5), 430-432 (1990).
- Okada, K., Tanaka, Y., Bernstein, M., Zhang, W., Patterson, G. A., Botney, M. D. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. Am J Pathol. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- van Albada, M. E., Schoemaker, R. G., Kemna, M. S., Cromme-Dijkhuis, A. H., van Veghel, R., Berger, R. M. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. Eur Respir J. 26 (3), 487-493 (2005).
- Brittain, E. Echocardiographic assessment of the right heart in mice. JVis Exp. (e81), (2013).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Molema, G., et al. Egr-1 expression during neointimal development in flow-associated pulmonary hypertension. Am J Pathol. 179 (5), 2199-2209 (2011).
- Borgdorff, M. A., Bartelds, B., Dickinson, M. G., Steendijk, P., de Vroomen, M., Berger, R. M. Distinct loading conditions reveal various patterns of right ventricular adaptation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (3), H354-H364 (2013).
- Ruiter, G., de Man, F. S., Schalij, I., et al. Reversibility of the monocrotaline pulmonary hypertension rat model. Eur Respir J. 42 (2), 553-556 (2013).
- van Albada, M. E., Bartelds, B., Wijnberg, H., et al. Gene expression profile in flow-associated pulmonary arterial hypertension with neointimal lesions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (4), L483-L491 (2010).
- Dickinson, M. G., Kowalski, P. S., Bartelds, B., et al. A critical role for egr-1 during vascular remodelling in pulmonary arterial hypertension. Cardiovasc Res. 103 (4), 573-584 (2014).
- van der Feen, D. E., Dickinson, M. G., Bartelds, M. G., et al. Egr-1 identifies neointimal remodeling and relates to progression in human pulmonary arterial hypertension. Jheart lung transplant. 35 (4), 481-490 (2016).
- Rungatscher, A. Chronic overcirculation-induced pulmonary arterial hypertension in aorto-caval shunt. Microvasc Res. 94, 73-79 (2014).
- O’Blenes, S. B., Fischer, S., McIntyre, B., Keshavjee, S., Rabinovitch, M. Hemodynamic unloading leads to regression of pulmonary vascular disease in rats. J Thorac Cardiovasc Surg. 121 (2), 279-289 (2001).
- Sakao, S., Taraseviciene-Stewart, L., Lee, J. D., Wood, K., Cool, C. D., Voelkel, N. F. Initial apoptosis is followed by increased proliferation of apoptosis-resistant endothelial cells. FASEB J. 19 (9), 1178-1180 (2005).
- Spiekerkoetter, E. FK506 activates BMPR2, rescues endothelial dysfunction, and reverses pulmonary hypertension. J Clin Invest. 123 (8), 3600-3613 (2013).
- Nickel, N. P., Spiekerkoetter, E., Gu, M., et al. Elafin reverses pulmonary hypertension via caveolin-1-dependent bone morphogenetic protein signaling. Am J Respir Crit Care Med. 191 (11), 1273-1286 (2015).
- Meloche, J., Potus, F., Vaillancourt, M., et al. Bromodomain-containing protein 4: The epigenetic origin of pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 117 (6), 525-535 (2015).
- Happé, C. M. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Ranchoux, B., Antigny, F., Rucker-Martin, C., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
- de Raaf, M. A. SuHx rat model: Partly reversible pulmonary hypertension and progressive intima obstruction. Eur Respy J. 44 (1), 160-168 (2014).
