शंट सर्जरी, सही दिल कैथीटेराइजेशन, और संवहनी Morphometry एक चूहे मॉडल में प्रवाह प्रेरित पल्मोनरी धमनी उच्च रक्तचाप के लिए
Summary
This protocol describes a surgical procedure to create a model for flow-induced pulmonary arterial hypertension (PAH) in rats and the procedures to analyze the principle hemodynamic and histological end-points in this model.
Abstract
In this protocol, PAH is induced by combining a 60 mg/kg monocrotalin (MCT) injection with increased pulmonary blood flow through an aorto-caval shunt (MCT+Flow). The shunt is created by inserting an 18-G needle from the abdominal aorta into the adjacent caval vein. Increased pulmonary flow has been demonstrated as an essential trigger for a severe form of PAH with distinct phases of disease progression, characterized by early medial hypertrophy followed by neointimal lesions and the progressive occlusion of the small pulmonary vessels. To measure the right heart and pulmonary hemodynamics in this model, right heart catheterization is performed by inserting a rigid cannula containing a flexible ball-tip catheter via the right jugular vein into the right ventricle. The catheter is then advanced into the main and the more distal pulmonary arteries. The histopathology of the pulmonary vasculature is assessed qualitatively, by scoring the pre- and intra-acinar vessels on the degree of muscularization and the presence of a neointima, and quantitatively, by measuring the wall thickness, the wall-lumen ratios, and the occlusion score.
Introduction
इस पद्धति का लक्ष्य चूहों में गंभीर, प्रवाह प्रेरित फेफड़े के धमनी उच्च रक्तचाप के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल बनाने के लिए और अपने सिद्धांत रक्तसंचारप्रकरण और histopathological अंत अंक उपाय है।
पल्मोनरी धमनी उच्च रक्तचाप (PAH) एक नैदानिक सिंड्रोम है कि सही निलय विफलता और मौत के लिए अग्रणी फेफड़े संवहनी प्रतिरोध में एक प्रगतिशील वृद्धि शामिल है। फेफड़े के उच्च रक्तचाप से ग्रस्त रोगों (पीएच) के उच्चकोटी रोग स्पेक्ट्रम के भीतर, पीएएच सबसे गंभीर रूप है और एक कि एक इलाज 1 के बिना बनी हुई है। पीएएच में अंतर्निहित धमनीविकृति कि पोत लुमेन occludes संवहनी remodeling के एक विशिष्ट रूप की विशेषता है। सामान्य गैर muscularized वाहिकाओं और औसत दर्जे का पोत परत की अतिवृद्धि के Muscularization पीएएच में जल्दी रोग घटना के रूप में माना जाता है, भी पीएच 2 के अन्य रूपों में देखा जाता है, और प्रतिवर्ती 3 माना जाता है। पीएएच एक के रूप मेंdvances, intimal परत फिर से तैयार करने के लिए, अंत में विशेषता neointimal घावों 2 बनाने शुरू होता है। Neointimal प्रकार फेफड़े संवहनी remodeling पीएएच के लिए विशेष है और वर्तमान में अपरिवर्तनीय 4 होना करने के लिए माना जाता है।
पीएएच एक दुर्लभ बीमारी है, इसकी pathobiological समझ में प्रगति और उपन्यास उपचारों के विकास के पशु मॉडल पर काफी भरोसा है। चूहों में monocrotalin (एमसीटी) मॉडल एक सरल एकल हिट मॉडल है कि कर दिया गया है, और अब भी, अक्सर इस्तेमाल किया जाता है। एमसीटी एक विष है कि फेफड़े धमनियों और क्षेत्रीय सूजन से 5 चोट का कारण बनता है। 60 मिलीग्राम / किग्रा एमसीटी मतलब फेफड़े के धमनी दबाव (mPAP), फेफड़े संवहनी प्रतिरोध (पीवीआर) में वृद्धि हो जाती है, और सही निलय अतिवृद्धि (RVH) 3 के बाद – 4 सप्ताह 6। Histomorphology neointimal घावों 5 के बिना पृथक औसत दर्जे का अतिवृद्धि की विशेषता है। एमसीटीचूहे मॉडल इस प्रकार, पीएच की एक उदारवादी रूप है, और न पीएएच का प्रतिनिधित्व करता है, हालांकि यह आमतौर पर बाद के रूप में प्रस्तुत किया है।
एक जन्मजात बायें से दायें अलग धकेलना (PAH-सीएचडी) के साथ जुड़े पीएएच के साथ बच्चों में वृद्धि हुई फेफड़े के रक्त के प्रवाह neointimal घावों 7, 8, 9 के विकास के लिए आवश्यक ट्रिगर के रूप में माना जाता है। चूहों में, वृद्धि हुई फेफड़े के रक्त के प्रवाह को उदर महाधमनी और रग कावा, पहली बार 1990 में 10 में वर्णित एक तकनीक के बीच एक अलग धकेलना के निर्माण के द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। बढ़ी हुई फेफड़े के प्रवाह पैदा करने के लिए विकल्प एकतरफा न्यूमोनेक्टॉमी द्वारा या फेफड़े के धमनी सम्मिलन से 11 subclavian से कर रहे हैं। इन मॉडलों के वैचारिक नुकसान न्यूमोनेक्टॉमी, या कारण फेफड़े vasculature की चिकित्सकजनित चोट के द्वारा प्रेरित शेष फेफड़ों और अनुकूली मार्ग सक्रियण के संभावित प्रतिपूरक विकास से मिलकर बनता हैफेफड़े के धमनी सम्मिलन के लिए, दोनों में वृद्धि हुई फेफड़े के रक्त के प्रवाह के प्रभाव confounding।
एक aorto-Caval अलग धकेलना बनाया और बढ़ फेफड़े के रक्त के प्रवाह एमसीटी इलाज चूहों में एक दूसरे हिट के रूप में प्रेरित किया जाता है, जब विशेषता neointimal घावों होते हैं, और पीएएच की एक गंभीर रूप और संबद्ध सही निलय विफलता (RVF) 3 सप्ताह विकसित के बाद बढ़ा प्रवाह 12। इस मॉडल में पीएएच का रक्तसंचारप्रकरण प्रगति इकोकार्डियोग्राफी और सही दिल कैथीटेराइजेशन द्वारा विवो में मूल्यांकन किया जा सकता है। संवहनी histomorphology, पोत दीवार मोटाई, arteriolar रोड़ा की डिग्री है, और मानकों को सही निलय विफलता के लिए पीएएच के पूर्व vivo लक्षण वर्णन के खंभे के रूप में।
इस विधि aorto-Caval अलग धकेलना (एसी-अलग धकेलना) सर्जरी के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल, सही दिल कैथीटेराइजेशन, और नाड़ी histomorphology के गुणात्मक और मात्रात्मक आकलन बताता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस विधि चूहों प्रवाह प्रेरित पीएएच और तकनीक सिद्धांत रक्तसंचारप्रकरण और histopathological अंत बताते हैं कि पीएएच और इस मॉडल को चिह्नित आकलन करने के लिए बनाने के लिए एमसीटी के साथ पूर्व इलाज में एक aorto-Caval अलग धकेलना…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Netherlands Cardiovascular Research Initiative, the Dutch Heart Foundation, the Dutch Federation of University Medical Centers, the Netherlands Organization for Health Research and Development, and the Royal Netherlands Academy of Sciences (CVON nr. 2012-08, PHAEDRA, The Sebald fund, Stichting Hartekind).
Materials
|
Shunt Surgery |
|||
| Sterile surgical gloves | |||
| Duratears Eye ointment | Alcon | 10380 | |
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Histoacryllic tissue glue | B. Braun Medical | 1050052 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Safil 4-0 sutures violet resorbable | B. Braun Medical | ||
| 18 G needle | Luer | NN1838R BD | tip bent in 45 degrees orifice to the outside |
| Gauzes 10×10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Temgesic Buprenorphine | RB Pharmaceuticals | 5429 | subcutaneous injection |
| Sodium Chloride 0.9 % | |||
| Ventilation mask Rat | |||
| Scalple blade | |||
| Biemer clamp 18 mm, 5 mm opening | AgnTho | 64-562 | |
| Heat mat | |||
| Kocher Clamp | |||
| Shaving machine | |||
| Microscope | Leica | ||
|
Right Heart Catheterization |
|||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile surgical gloves | |||
| Eye ointment | Duratears | ||
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Gauzes 10×10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Needle 20 G | Luer | Tip slightly bent to the inside | |
| Cannula 20 G | Luer | to introduce catheter, tip pre-formed in 20 degrees | |
| Silastic Catheter 15 cm long | 0.5 mm ball 2 mm from tip | ||
| Pressure transducer | Ailtech | ||
| Bedside monitor Cardiocap/5 | Datex-Ohmeda | ||
| Shaving machine | |||
| 10mL Syringe | |||
| Sodium Chloride 0.9 % | for flushing | ||
|
Vascular Morphology |
|||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50ml Syringe | |||
| 4 % Formaldehyde | |||
| 18 G cannula with tube | |||
| Verhoef staining kit | Sigma-Aldrich | HT254 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US |
| Digital slide scanner | Hamamatsu | C9600 | |
| Image-J | |||
| Elastic (Connective Tissue Stain) | Abcam | ab150667 | http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html |
| http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf |
Riferimenti
- Hoeper, M. M., Bogaard, H. J., Condliffe, R., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. J Am Coll Cardiol. 62, D42-D50 (2013).
- Stacher, E., Graham, B. B., Hunt, J. M., et al. Modern age pathology of pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 186 (3), 261-272 (2012).
- Levy, M., Maurey, C., Celermajer, D. S., et al. Impaired apoptosis of pulmonary endothelial cells is associated with intimal proliferation and irreversibility of pulmonary hypertension in congenital heart disease. J Am Coll Cardiol. 49 (7), 803-810 (2007).
- Sakao, S., Tatsumi, K., Voelkel, N. F. Reversible or irreversible remodeling in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 629-634 (2010).
- Gomez-Arroyo, J. G., Farkas, L., Alhussaini, A. A., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (4), L363-L369 (2012).
- Jones, J. E. Serial noninvasive assessment of progressive pulmonary hypertension in a rat model. Am J Physiol – Heart Circ Physiol. 283 (1), 364-371 (2002).
- Hoffman, J. I., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Pulmonary vascular disease with congenital heart lesions: Pathologic features and causes. Circulation. 64 (5), 873-877 (1981).
- van Albada, M. E., Berger, R. M. Pulmonary arterial hypertension in congenital cardiac disease–the need for refinement of the evian-venice classification. Cardiol Young. 18 (1), 10-17 (2008).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A., Berger, R. M. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: Lessons from preclinical animal models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Garcia, R., Diebold, S. Simple, rapid, and effective method of producing aortocaval shunts in the rat. Cardiovasc Res. 24 (5), 430-432 (1990).
- Okada, K., Tanaka, Y., Bernstein, M., Zhang, W., Patterson, G. A., Botney, M. D. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. Am J Pathol. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- van Albada, M. E., Schoemaker, R. G., Kemna, M. S., Cromme-Dijkhuis, A. H., van Veghel, R., Berger, R. M. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. Eur Respir J. 26 (3), 487-493 (2005).
- Brittain, E. Echocardiographic assessment of the right heart in mice. JVis Exp. (e81), (2013).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Molema, G., et al. Egr-1 expression during neointimal development in flow-associated pulmonary hypertension. Am J Pathol. 179 (5), 2199-2209 (2011).
- Borgdorff, M. A., Bartelds, B., Dickinson, M. G., Steendijk, P., de Vroomen, M., Berger, R. M. Distinct loading conditions reveal various patterns of right ventricular adaptation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (3), H354-H364 (2013).
- Ruiter, G., de Man, F. S., Schalij, I., et al. Reversibility of the monocrotaline pulmonary hypertension rat model. Eur Respir J. 42 (2), 553-556 (2013).
- van Albada, M. E., Bartelds, B., Wijnberg, H., et al. Gene expression profile in flow-associated pulmonary arterial hypertension with neointimal lesions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (4), L483-L491 (2010).
- Dickinson, M. G., Kowalski, P. S., Bartelds, B., et al. A critical role for egr-1 during vascular remodelling in pulmonary arterial hypertension. Cardiovasc Res. 103 (4), 573-584 (2014).
- van der Feen, D. E., Dickinson, M. G., Bartelds, M. G., et al. Egr-1 identifies neointimal remodeling and relates to progression in human pulmonary arterial hypertension. Jheart lung transplant. 35 (4), 481-490 (2016).
- Rungatscher, A. Chronic overcirculation-induced pulmonary arterial hypertension in aorto-caval shunt. Microvasc Res. 94, 73-79 (2014).
- O’Blenes, S. B., Fischer, S., McIntyre, B., Keshavjee, S., Rabinovitch, M. Hemodynamic unloading leads to regression of pulmonary vascular disease in rats. J Thorac Cardiovasc Surg. 121 (2), 279-289 (2001).
- Sakao, S., Taraseviciene-Stewart, L., Lee, J. D., Wood, K., Cool, C. D., Voelkel, N. F. Initial apoptosis is followed by increased proliferation of apoptosis-resistant endothelial cells. FASEB J. 19 (9), 1178-1180 (2005).
- Spiekerkoetter, E. FK506 activates BMPR2, rescues endothelial dysfunction, and reverses pulmonary hypertension. J Clin Invest. 123 (8), 3600-3613 (2013).
- Nickel, N. P., Spiekerkoetter, E., Gu, M., et al. Elafin reverses pulmonary hypertension via caveolin-1-dependent bone morphogenetic protein signaling. Am J Respir Crit Care Med. 191 (11), 1273-1286 (2015).
- Meloche, J., Potus, F., Vaillancourt, M., et al. Bromodomain-containing protein 4: The epigenetic origin of pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 117 (6), 525-535 (2015).
- Happé, C. M. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Ranchoux, B., Antigny, F., Rucker-Martin, C., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
- de Raaf, M. A. SuHx rat model: Partly reversible pulmonary hypertension and progressive intima obstruction. Eur Respy J. 44 (1), 160-168 (2014).
