Shunt Surgery, Høyre hjertekateterisering, og Vaskulær morfometri i en rottemodell for Flow-indusert pulmonal arteriell hypertensjon

Summary

This protocol describes a surgical procedure to create a model for flow-induced pulmonary arterial hypertension (PAH) in rats and the procedures to analyze the principle hemodynamic and histological end-points in this model.

Abstract

In this protocol, PAH is induced by combining a 60 mg/kg monocrotalin (MCT) injection with increased pulmonary blood flow through an aorto-caval shunt (MCT+Flow). The shunt is created by inserting an 18-G needle from the abdominal aorta into the adjacent caval vein. Increased pulmonary flow has been demonstrated as an essential trigger for a severe form of PAH with distinct phases of disease progression, characterized by early medial hypertrophy followed by neointimal lesions and the progressive occlusion of the small pulmonary vessels. To measure the right heart and pulmonary hemodynamics in this model, right heart catheterization is performed by inserting a rigid cannula containing a flexible ball-tip catheter via the right jugular vein into the right ventricle. The catheter is then advanced into the main and the more distal pulmonary arteries. The histopathology of the pulmonary vasculature is assessed qualitatively, by scoring the pre- and intra-acinar vessels on the degree of muscularization and the presence of a neointima, and quantitatively, by measuring the wall thickness, the wall-lumen ratios, and the occlusion score.

Introduction

Målet med denne metoden er å skape en reproduserbar modell for alvorlig, flow-indusert pulmonal arteriell hypertensjon hos rotter og måle dens prinsipp hemodynamisk og histopatologiske endepunkter.

Pulmonal arteriell hypertensjon (PAH) er et klinisk syndrom som omfatter en progressiv økning i pulmonal vaskulær motstand fører til høyre ventrikkel svikt og død. Innenfor det overordnede sykdommen spekteret av lunge hypertensive sykdommer (PH), er PAH den mest alvorlige formen og en som fortsatt er uten en kur ^en. Den underliggende arteriopathy i PAH er preget av en typisk form for vaskulær remodellering som tetter årehulrommet. Muscularization av normale ikke-muscularized fartøy og hypertrofi av den mediale fartøyet lag betraktes som begynnelsen av sykdomsfenomener i PAH, ses også i andre former for PH ^2, og antas å være reversibel ^3. Som PAH etdvances begynner intimal lag til oppussing, til slutt danner karakteristiske neointimale lesjoner ^2. Neointimale-type pulmonal vaskulær remodeling er eksklusiv for PAH og er ansett for å være irreversible ^4.

Som PAH er en sjelden sykdom, fremskritt i sin pathobiological forståelse og utviklingen av nye behandlingsformer har støttet seg tungt på dyremodeller. Den monocrotalin (MCT) modell i rotter er en enkel enkelt hit modell som har vært, og fortsatt er, brukes ofte. MCT er en gift som fører til skade på lunge arterioler og regional betennelse ^5. 60 mg / kg MCT fører til en økning i gjennomsnittelig pulmonalt arterietrykk (mPAP), pulmonar vaskulær motstand (PVR), og høyre ventrikkel hypertrofi (RVH) etter 3 – 4 uker ^6. Den histomorphology er preget av isolerte medial hypertrofi uten neointimale lesjoner ^5. MCTrottemodell representerer således en moderat form av PH, og ikke PAH, men det er ofte presentert som det sistnevnte.

Hos barn med PAH assosiert med en medfødt venstre til høyre shunt (PAH-CHD), økt lungeblodstrøm regnes som viktig trigger for utviklingen av neointimale lesjoner ^{7, 8, 9.} Hos rotter kan økt pulmonal blodstrøm induseres av etableringen av en shunt mellom abdominal aorta og vena cava, en teknikk først beskrevet i 1990 ^10. Alternativer for å skape økt lunge flyt er ved ensidig pneumonectomy eller subclavia til lungearterien anastomose ^11. Begrepsmessige ulemper ved disse modellene består av potensiell kompenserende vekst av den gjenværende lunge og adaptiv bane aktivering indusert ved pneumonectomy, eller av iatrogen skade av det pulmonale vaskulatur grunntil lungearterien anastomose, både konfunderende effekter av økt pulmonal blodstrøm.

Når en aorto-cava shunt er opprettet og øket lungeblodstrøm blir indusert som et andre hit i MCT-behandlede rotter, karakteristiske neointimale lesjoner forekommer, og en alvorlig form av PAH og tilhørende svikt i høyre hjertekammer (RVF) utvikle 3 uker etter den økede flyt ^12. Den hemodynamiske progresjon av PAH i denne modellen kan vurderes in vivo ved ekkokardiografi og høyre hjertekateterisering. Den vaskulære histomorphology, fartøy veggtykkelse, grad av arteriolar okklusjon, og parametere for høyre ventrikkel svikt danner bærebjelkene i ex vivo karakterisering av PAH.

Denne metoden beskriver detaljerte protokoller for aorto-cava shunt (AC-shunt) kirurgi, høyre hjertekateterisering, og kvalitativ og kvantitativ vurdering av vaskulær histomorphology.

Protocol

Prosedyrer som involverer dyr fag har blitt godkjent av det nederlandske sentralkomiteen for dyreforsøk og Animal Care Utvalget ved University Medical Center Groningen (NL). Både Wistar og Lewis-rotter med en vekt på mellom 180 og 300 g ble anvendt. 1. Bolig og Akklimatisering Etter ankomst til sentrale Dyreavdelingen, house rotter i grupper på 5 per bur. I løpet av en 7-dagers akklimatisering periode, venne rottene til menneskelig håndtering, men ikke utføre eksperimentell…

Representative Results

Representative resultater er vist i figur 4. De presenterte resultatene viser karakteristikker av MCT + FLOW i Lewis rotter i følgende grupper: Kontroll (n = 3), MF8 (n = 5), MF14 (n = 5), MF28 (n = 5), og MF-RVF ( n = 10). Statistiske analyser ble utført ved anvendelse av en enveis ANOVA med Bonferroni korreksjon. 60 mg / kg MCT og øket lungeblodstrøm fører til en midlere økning i systolisk høyre ventr…

Discussion

Denne fremgangsmåten beskriver den kirurgiske prosedyren ifølge en aorto-cava shunt hos rotter forbehandlet med MCT for å skape strømningsinduserte PAH og teknikker for å bedømme prinsippet hemodynamiske og histopatologiske sluttpunkt som karakteriserer PAH og denne modellen.

Kritiske trinn i protokollen og feilsøking

Kirurgi og etter operasjonen. Under aorto-cava shunt kirurgi, er den mest kritiske trinnet disseksjon av aorta og vena cava. Membranene som oms…

Materials

Shunt Surgery
Sterile surgical gloves
Duratears Eye ointment	Alcon	10380
Chloride-Hexidine
Cotton swabs
Histoacryllic tissue glue	B. Braun Medical	1050052
Silkam 5-0 sutures black non-resorbable	B. Braun Medical	F1134027
Safil 4-0 sutures violet resorbable	B. Braun Medical
18 G needle	Luer	NN1838R BD	tip bent in 45 degrees orifice to the outside
Gauzes 10×10 cm	Paul Hartmann	407825
Temgesic Buprenorphine	RB Pharmaceuticals	5429	subcutaneous injection
Sodium Chloride 0.9 %
Ventilation mask Rat
Scalple blade
Biemer clamp 18 mm, 5 mm opening	AgnTho	64-562
Heat mat
Kocher Clamp
Shaving machine
Microscope	Leica
Right Heart Catheterization
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterile surgical gloves
Eye ointment	Duratears
Chloride-Hexidine
Cotton swabs
Gauzes 10×10 cm	Paul Hartmann	407825
Silkam 5-0 sutures black non-resorbable	B. Braun Medical	F1134027
Needle 20 G	Luer		Tip slightly bent to the inside
Cannula 20 G	Luer		to introduce catheter, tip pre-formed in 20 degrees
Silastic Catheter 15 cm long			0.5 mm ball 2 mm from tip
Pressure transducer	Ailtech
Bedside monitor Cardiocap/5	Datex-Ohmeda
Shaving machine
10mL Syringe
Sodium Chloride 0.9 %			for flushing
Vascular Morphology
Name	Company	Catalog Number	Comments
50ml Syringe
4 % Formaldehyde
18 G cannula with tube
Verhoef staining kit	Sigma-Aldrich	HT254	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en&region=US
Digital slide scanner	Hamamatsu	C9600
Image-J
Elastic (Connective Tissue Stain)	Abcam	ab150667	http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html
			http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf