Шунтов, катетеризация правых отделов сердца, и сосудистому Морфометрия в крысиной модели для Flow-индуцированной легочной артериальной гипертензии
Summary
This protocol describes a surgical procedure to create a model for flow-induced pulmonary arterial hypertension (PAH) in rats and the procedures to analyze the principle hemodynamic and histological end-points in this model.
Abstract
In this protocol, PAH is induced by combining a 60 mg/kg monocrotalin (MCT) injection with increased pulmonary blood flow through an aorto-caval shunt (MCT+Flow). The shunt is created by inserting an 18-G needle from the abdominal aorta into the adjacent caval vein. Increased pulmonary flow has been demonstrated as an essential trigger for a severe form of PAH with distinct phases of disease progression, characterized by early medial hypertrophy followed by neointimal lesions and the progressive occlusion of the small pulmonary vessels. To measure the right heart and pulmonary hemodynamics in this model, right heart catheterization is performed by inserting a rigid cannula containing a flexible ball-tip catheter via the right jugular vein into the right ventricle. The catheter is then advanced into the main and the more distal pulmonary arteries. The histopathology of the pulmonary vasculature is assessed qualitatively, by scoring the pre- and intra-acinar vessels on the degree of muscularization and the presence of a neointima, and quantitatively, by measuring the wall thickness, the wall-lumen ratios, and the occlusion score.
Introduction
Цель этого метода заключается в создании воспроизводимой модели для тяжелой, течения индуцированной легочной артериальной гипертензии у крыс и измерить его принцип гемодинамические и гистопатологические конечные точки.
Легочной артериальной гипертензии (ЛАГ) является клиническим синдромом, который охватывает прогрессивное увеличение легочного сосудистого сопротивления, ведущего к правожелудочковой недостаточности и смерти. В вышестоящем спектра заболеваний легочных гипертонической болезни (PH), ЛАГ является самой тяжелой формой и тот , который остается без лечения 1. Основополагающей артериопатия в PAH характеризуется типичной формой ремоделирования сосудов, что закупоривает просвет сосуда. Muscularization нормальных , не muscularized сосудов и гипертрофии медиальной слоя сосуда рассматриваются как ранние явления болезни при ЛАГ, наблюдаются также в других формах ЛГ 2, и , как полагают, быть обратимым 3. Как ПАГ аdvances, интимы слой начинает перестраивать, в конце концов , образуя характерные неоинтимального поражения 2. Неоинтимального типа легочного сосудистого ремоделирования является эксклюзивным для ЛАГ и в настоящее время считается необратимым 4.
Как PAH является редким заболеванием, прогресс в его pathobiological понимания и разработка новых методов лечения уже в значительной степени полагались на животных моделях. Monocrotalin (MCT) модели у крыс простой одиночный удар модель , которая была, и до сих пор, часто используется. МСТ является токсин , который вызывает повреждение легочных артериол и региональное воспаление 5. 60 мг / кг МСТ приводит к увеличению среднего давления в легочной артерии (MPAP), легочное сосудистое сопротивление (PVR), и гипертрофия правого желудочка (РВГ) через 3 – 4 недели 6. Histomorphology характеризуется изолированной медиальной гипертрофии без неоинтимы поражений 5. МСТТаким образом, модель крысы представляет собой умеренную форму PH, а не PAH, хотя обычно представляется как последний.
У детей с ЛАГ , связанной с врожденным слева направо шунта (PAH-КБС), увеличение легочного кровотока считается существенным триггером для развития неоинтимы поражений 7, 8, 9. У крыс, усиление легочного кровотока может быть индуцирована путем создания шунта между брюшной аортой и полой веной, методика впервые была описана в 1990 году 10. Альтернативы создают повышенную легочную потока являются односторонними пневмонэктомии либо подключичную к анастомоза легочной артерии 11. Концептуальные недостатки этих моделей состоит из потенциальной компенсационного роста оставшегося легкого и адаптивной активации пути, вызванного пневмонэктомии или ятрогенного повреждения легочной сосудистой сети из-зак анастомозом легочной артерии, как путая последствия увеличения легочного кровотока.
Когда аорто-кавальной шунт создается и усиление легочного кровотока индуцируется в качестве второго попадания в МСТ крыс, характерные неоинтимального поражения происходят, и тяжелая форма ЛАГ и связанных с ними недостаточность правого желудочка (ФВР) развиваются через 3 недели после того, как увеличение 12 потока. Прогрессирование гемодинамика ЛАГ в этой модели можно оценить в естественных условиях с помощью эхокардиографии и катетеризации правых отделов сердца. Сосудистый histomorphology, толщина стенки сосуда, степень артериол окклюзии, а также параметры для правого желудочка неудачи образуют устои экс естественных характеристик ЛАГ.
Этот метод описывает подробные протоколы для операции аорто-кавальной шунта (AC-шунт), катетеризация правых отделов сердца, а также качественную и количественную оценку сосудистого histomorphology.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод описывает хирургическую процедуру с аорто-кавальной шунта у крыс, предварительно обработанных МСТ для создания индуцированной движением PAH и методики оценки принцип гемодинамические и гистопатологические конечные точки, которые характеризуют PAH и эту модель.
<p class="jove_step"…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Netherlands Cardiovascular Research Initiative, the Dutch Heart Foundation, the Dutch Federation of University Medical Centers, the Netherlands Organization for Health Research and Development, and the Royal Netherlands Academy of Sciences (CVON nr. 2012-08, PHAEDRA, The Sebald fund, Stichting Hartekind).
Materials
|
Shunt Surgery |
|||
| Sterile surgical gloves | |||
| Duratears Eye ointment | Alcon | 10380 | |
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Histoacryllic tissue glue | B. Braun Medical | 1050052 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Safil 4-0 sutures violet resorbable | B. Braun Medical | ||
| 18 G needle | Luer | NN1838R BD | tip bent in 45 degrees orifice to the outside |
| Gauzes 10×10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Temgesic Buprenorphine | RB Pharmaceuticals | 5429 | subcutaneous injection |
| Sodium Chloride 0.9 % | |||
| Ventilation mask Rat | |||
| Scalple blade | |||
| Biemer clamp 18 mm, 5 mm opening | AgnTho | 64-562 | |
| Heat mat | |||
| Kocher Clamp | |||
| Shaving machine | |||
| Microscope | Leica | ||
|
Right Heart Catheterization |
|||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile surgical gloves | |||
| Eye ointment | Duratears | ||
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Gauzes 10×10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Needle 20 G | Luer | Tip slightly bent to the inside | |
| Cannula 20 G | Luer | to introduce catheter, tip pre-formed in 20 degrees | |
| Silastic Catheter 15 cm long | 0.5 mm ball 2 mm from tip | ||
| Pressure transducer | Ailtech | ||
| Bedside monitor Cardiocap/5 | Datex-Ohmeda | ||
| Shaving machine | |||
| 10mL Syringe | |||
| Sodium Chloride 0.9 % | for flushing | ||
|
Vascular Morphology |
|||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50ml Syringe | |||
| 4 % Formaldehyde | |||
| 18 G cannula with tube | |||
| Verhoef staining kit | Sigma-Aldrich | HT254 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US |
| Digital slide scanner | Hamamatsu | C9600 | |
| Image-J | |||
| Elastic (Connective Tissue Stain) | Abcam | ab150667 | http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html |
| http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf |
Riferimenti
- Hoeper, M. M., Bogaard, H. J., Condliffe, R., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. J Am Coll Cardiol. 62, D42-D50 (2013).
- Stacher, E., Graham, B. B., Hunt, J. M., et al. Modern age pathology of pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 186 (3), 261-272 (2012).
- Levy, M., Maurey, C., Celermajer, D. S., et al. Impaired apoptosis of pulmonary endothelial cells is associated with intimal proliferation and irreversibility of pulmonary hypertension in congenital heart disease. J Am Coll Cardiol. 49 (7), 803-810 (2007).
- Sakao, S., Tatsumi, K., Voelkel, N. F. Reversible or irreversible remodeling in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 629-634 (2010).
- Gomez-Arroyo, J. G., Farkas, L., Alhussaini, A. A., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (4), L363-L369 (2012).
- Jones, J. E. Serial noninvasive assessment of progressive pulmonary hypertension in a rat model. Am J Physiol – Heart Circ Physiol. 283 (1), 364-371 (2002).
- Hoffman, J. I., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Pulmonary vascular disease with congenital heart lesions: Pathologic features and causes. Circulation. 64 (5), 873-877 (1981).
- van Albada, M. E., Berger, R. M. Pulmonary arterial hypertension in congenital cardiac disease–the need for refinement of the evian-venice classification. Cardiol Young. 18 (1), 10-17 (2008).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A., Berger, R. M. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: Lessons from preclinical animal models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Garcia, R., Diebold, S. Simple, rapid, and effective method of producing aortocaval shunts in the rat. Cardiovasc Res. 24 (5), 430-432 (1990).
- Okada, K., Tanaka, Y., Bernstein, M., Zhang, W., Patterson, G. A., Botney, M. D. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. Am J Pathol. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- van Albada, M. E., Schoemaker, R. G., Kemna, M. S., Cromme-Dijkhuis, A. H., van Veghel, R., Berger, R. M. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. Eur Respir J. 26 (3), 487-493 (2005).
- Brittain, E. Echocardiographic assessment of the right heart in mice. JVis Exp. (e81), (2013).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Molema, G., et al. Egr-1 expression during neointimal development in flow-associated pulmonary hypertension. Am J Pathol. 179 (5), 2199-2209 (2011).
- Borgdorff, M. A., Bartelds, B., Dickinson, M. G., Steendijk, P., de Vroomen, M., Berger, R. M. Distinct loading conditions reveal various patterns of right ventricular adaptation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (3), H354-H364 (2013).
- Ruiter, G., de Man, F. S., Schalij, I., et al. Reversibility of the monocrotaline pulmonary hypertension rat model. Eur Respir J. 42 (2), 553-556 (2013).
- van Albada, M. E., Bartelds, B., Wijnberg, H., et al. Gene expression profile in flow-associated pulmonary arterial hypertension with neointimal lesions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (4), L483-L491 (2010).
- Dickinson, M. G., Kowalski, P. S., Bartelds, B., et al. A critical role for egr-1 during vascular remodelling in pulmonary arterial hypertension. Cardiovasc Res. 103 (4), 573-584 (2014).
- van der Feen, D. E., Dickinson, M. G., Bartelds, M. G., et al. Egr-1 identifies neointimal remodeling and relates to progression in human pulmonary arterial hypertension. Jheart lung transplant. 35 (4), 481-490 (2016).
- Rungatscher, A. Chronic overcirculation-induced pulmonary arterial hypertension in aorto-caval shunt. Microvasc Res. 94, 73-79 (2014).
- O’Blenes, S. B., Fischer, S., McIntyre, B., Keshavjee, S., Rabinovitch, M. Hemodynamic unloading leads to regression of pulmonary vascular disease in rats. J Thorac Cardiovasc Surg. 121 (2), 279-289 (2001).
- Sakao, S., Taraseviciene-Stewart, L., Lee, J. D., Wood, K., Cool, C. D., Voelkel, N. F. Initial apoptosis is followed by increased proliferation of apoptosis-resistant endothelial cells. FASEB J. 19 (9), 1178-1180 (2005).
- Spiekerkoetter, E. FK506 activates BMPR2, rescues endothelial dysfunction, and reverses pulmonary hypertension. J Clin Invest. 123 (8), 3600-3613 (2013).
- Nickel, N. P., Spiekerkoetter, E., Gu, M., et al. Elafin reverses pulmonary hypertension via caveolin-1-dependent bone morphogenetic protein signaling. Am J Respir Crit Care Med. 191 (11), 1273-1286 (2015).
- Meloche, J., Potus, F., Vaillancourt, M., et al. Bromodomain-containing protein 4: The epigenetic origin of pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 117 (6), 525-535 (2015).
- Happé, C. M. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Ranchoux, B., Antigny, F., Rucker-Martin, C., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
- de Raaf, M. A. SuHx rat model: Partly reversible pulmonary hypertension and progressive intima obstruction. Eur Respy J. 44 (1), 160-168 (2014).
