마이크로 열 영동을 사용하여 ATP에 앱 타머의 결합 부위를 매핑

Summary

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Abstract

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

Introduction

분자 사이의 상호 작용은 자연의 기초가된다. 따라서, 기본 및 응용 연구의 많은 분야에서 과학자들은 서로 다른 종류의 분자 상호 작용의 기본 원리를 이해하려고합니다. 마이크로 열 영동 (MST)는 버퍼의 자유로운 선택으로, 용액에서 분자 상호 작용의 빠르고 정확한 비용 효율성 및 품질 제어 특성을 수행하는 과학자들 수 있습니다. 여러 결합 파트너 ^1-8으로 이벤트 유효성 검사, 경쟁 분석, 실험을 결합, 도서관 검사를 포함한 분석의 다른 종류를, 기술, 혼자 2016에서 MST를 사용하여 1,000 개 이상의 출판물이 이미 있습니다. 일반적으로, MST는 분자 상호 작용의 어떤 종류의 결합 친화 (mM의 PM), 화학 양론, 열역학, 같은 고전적인 바인딩 매개 변수에 대한 연구를 허용합니다. MST의 큰 장점은 상호 작용 파트너의 크기의 독립적 인 바인딩 이벤트를 공부할 수있는 기능입니다. 심지어 chal같은 작은 분자, 약물, 항생제, 또는 대사 산물로 같은의 작은 핵산 앱 타머 사이의 상호 작용 (NT를 15 ~ 30) 및 목표 정량화 할 수있다.

현재 최첨단 기술은 압 타머 – 대상의 상호 작용이 실험실 강렬하고 매우 복잡한 중 하나입니다 특성화 또는 앱 타머 – 작은 분자가 ^9,10의 상호 작용을 정량화하는 데 실패합니다. 플라즈몬 공명 (SPR)를 분석 ^{(11, 12)} 및 등온 적정 열량계 (ITC) ^{13 ~ 15,} 등용 매 용리 ¹⁶ 평형 Fi를 여과에 ^{17, 18으로} 진정으로 라벨없는 열량 접근 방식을 기반 표면에 라인 ^19, 겔을 프로빙 분석을 이동, stopped- FL 흐름 FL uorescence 분광법 ^{(20, 21),} 형광 이방성 (FA) ^{22, 23,} 단일 분자 FL uorescence 영상 ^{24, 25,} 및 바이오 층 간섭 (BLI) ^(26)는 압 타머 – 작은 분자와 부정확 또는 호환되지 않는 중 하나입니다 상호 작용. 기타 principa이러한 방법의 리터 문제는 낮은 민감도, 높은 샘플 소비, 고정, 표면에 대량 전송 제한 및 / 또는 버퍼 제한됩니다. 이러한 기술의 몇 응집 흡착 효과에 대한 통합 제어를 제공합니다.

MST 과학자 단백질 ^30-33로서 앱 타머 및 소분자 ^27-29 사이의 상호 작용뿐만 아니라 다른 대상을 연구하는 이러한 한계를 극복하기위한 강력한 도구를 나타낸다. 이 기술은 온도 구배를 통해 분자의 움직임에 의존한다. 라고하는이 감독 운동 "열 영동는"분자 ^{(34, 35)의} 크기, 비용 및 수화 쉘에 따라 달라집니다. 분자에 대한 리간드의 결합을 직접 변경 thermophoretic 이동성 결과 이들 파라미터 중 적어도 하나를 변경한다. 작은 크기와 리간드가 결합 된 상태로 결합되지 않은에서 크기 변화의 측면에서 상당한 영향을 미칠하지 않을 수 있습니다,하지만 그들은 닥터를 가질 수 있습니다 수화 쉘 및 / 또는 충전 amatic 효과. 결합 파트너와의 상호 작용 후 분자의 thermophoretic 운동의 변화는 기본 바인딩 매개 변수 ^{2,7,34,36,37의} 정량화 할 수 있습니다.

도 1a에 도시 된 바와 같이, MST 장치는 형광 검출과 같은 광학 장치를 이용하여 유리 모세관 내 샘플 상에 초점 적외선 레이저로 구성된다. 레이저 온도 구배 (2-6 ℃의 ΔT)을 설정하면서 tryptophans ⁶ 또는 형광 표지의 상호 작용 파트너의 ^3,8의 고유의 FL uorescence 통한 단백질의 thermophoretic 움직임 모니터링 할 수있다. 공간 ΔT에서 생성 된 온도 차이는 Soret 의해 정량화 될 수있다 고온의 영역에서 공핍 또는 분자의 축적에 이르게 COEF 효율적인 인터넷 (S _T)

g "/>

C _고온 가열 영역의 농도를 나타내고, C _{감기 초기} 저온 영역에서의 농도이다.

도 1b는 각자의 시간 척도에 의해 분리 될 수있는 여러 단계들로 구성된 MST 운동 프로파일 (시간 추적)에서 전형적인 MST 실험 결과에 도시 된 바와 같이. 초기 형광 정확한 시작 형광을 정의하고 또는 photoenhancement photobleaching에 대해 확인하기 위해 온도 구배의 부재에서 제 5 초 단위로 측정된다. 온도 점프 (T-점프)하는 형광 변화 thermophoretic 운동 전에 위상을 나타냅니다. 형광이 초기 감소는 양자 수율 uorophore 플로리다의 열 의존적 변화에 따라 달라집니다. 열 영동 상 인해 정상 분포까지 분자의 운동 thermophoretic 형광이 감소 (또는 증가)에 도달 한 다음.레이저가 꺼진 후 그림 (b)에 나타낸 바와 같이 역 TJump와 플로리다 uorescent 분자의 수반 다시 확산 관찰 할 수있다. 기본적인 결합 매개 변수를 액세스하기 위해, 상호 작용 파트너의 상이한 몰비를 분석 및 비교된다. 광학 표시 분자가 일정하게 유지되고, 표지 된 리간드의 양의 증가와 함께 공급되는 반면, 일반적으로 16 개의 다른 비율 번 MST 실험에서 연구되었다. 두 결합 파트너 간의 상호 작용은 열 영동의 변화를 유도하고, 따라서 표준화의 FL uorescence에서는, 다음과 같이 계산된다 F _규범 :

F _뜨거운 F _감기는 MST 추적의 드 Fi를 NED 시점에서 플라이 uorescence 강도 평균 나타냅니다. 결합 친화도 (K _d 또는 EC ₅₀ 값) CURV 의해 계산 될 수있다E 피팅 (도 1C).

전반적으로, MST는 어떤 종류의 분자 상호 작용을 연구하는 강력한 도구입니다. 그리고 25-NT의 짧은 ssDNA를 앱 타머 DH25.42 (7.9 kDa의)이 원고는 작은 분자 아데노신 트리 포스페이트 (0.5 kDa의 ATP) 사이의 도전적인 상호 작용을 특성화하기위한 프로토콜을 제공합니다. 원고의 과정 동안, ATP 분자의 앱 타머의 결합 부위는 ATP의 아데닌 그룹에 아래로 매핑됩니다.

Protocol

앱타 머는 작업 증권 1. 준비 제조업체의 지침에 따라 100 μm의 최종 농도에 도달, 물 (참조 18에서 5-Cy5에-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, 순서) 올리고 뉴클레오티드를 녹인다. 버퍼를 결합 200 nm의에 올리고 뉴클레오티드 주식을 희석하여 앱 타머 작업 솔루션을 준비합니다 (20 mM 트리스, 산도 7.6, 300 mM의 NaCl을 5 밀리미터의 MgCl 2, 0.01 % 트윈 20). 90 ℃에서 2 분 동안 혼합…

Representative Results

본 연구에서는, MST는 ATP의 DH25.42 DNA 앱 타머 (18)의 결합 부위의 특성을 적용 하였다. ATP 또는 임의로 하나 이상의 형광 38-40 표지 단백질과 소형 분자 ATP를 흉내 낸의 상호 작용의 특성을 다른 연구와 대조적으로, 본 연구에서는 5 '말단에 한 Cy5의 분자와 7.9 kDa의 ssDNA를 앱 타머에 표지 된 버전을 포함 . 다른 ATP 유도체 및 관련 분자는 다양한 위치에서 ATP ?…

Discussion

품질 관리 :

비특이적 부착 / 표면에 시료 물질뿐만 아니라, 응집 효과를 흡착, 선호도 데이터의 품질에 큰 영향을 미친다. 그러나, 몇 최첨단 기술을 모니터링하고 이러한 효과를 방지하기 정확하고 빠른 옵션을 제공합니다. MST 감지하고 기술적 인 설치의 단계적 최적화를 허용, 이러한 문제를 극복하는 데 도움이 통합 된 품질 관리를 제공합니다. 응집 / 침전 효과 (단계 7.7)의 …

Materials

Aptamer binding buffer			20 mM Tris pH7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01%Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer	IDT, Leuven, Belgium		sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Germany	A2383	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
ADP	Sigma Aldrich, Germany	A2754	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
AMP	Sigma Aldrich, Germany	A2252	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
Adenine	Sigma Aldrich, Germany	A8626	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
SAM	Sigma Aldrich, Germany	A7007	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
dATP	Sigma Aldrich, Germany	11934511001	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
CTP	Sigma Aldrich, Germany	C1506	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
GTP	Sigma Aldrich, Germany	G8877	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies, Munich, Germany	MO-G008	Blue/Red Channel MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard	NanoTemper Technologies, Munich, Germany	MO-K002
Eppendorf PCR tubes	Eppendorf, Germany	30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device	NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1	NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2	Synergy Software