映射的适体对ATP的结合部位使用MicroScale程序热泳

Summary

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Abstract

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

Introduction

分子之间的相互作用是自然的基础。因此，科学家基础和应用研究的众多领域尝试了解不同种类的分子相互作用的基本原则。 MicroScale程序热泳（MST），科学家可以在溶液中进行快速，精确，成本效益和质量控制的分子间相互作用的特征，与缓冲区的自由选择。目前已经有超过1000出版物使用MST，2016年独自一人，描述不同类型的分析，包括图书馆放映，结合事件验证，竞争分析，和实验与多个合作伙伴的结合^1-8。在一般情况下，台MST允许古典结合参数，如任何类型的分子相互作用的结合亲和力（1pM至毫米），化学计量，和热力学，研究。 MST的一大优点是研究独立的互动合作伙伴的大小结合事件的能力。即使CHAL目标小核酸适体之间有挑战性相互作用（15-30个核苷酸）和诸如小分子，药物，抗生素，或代谢产物可以定量。

当前国家的最先进的技术来表征适体靶相互作用或者是实验室强烈和高度复杂的或无法量化适配子的小分子的相互作用^9,10。表面等离子体共振（SPR）为基础的试验^11,12和真正的无标记热量的方法，如温滴定量热^{（ITC）13-15}度洗脱^16，平衡渗透^17,18，在线探测^19，凝胶-移位测定，stopped-溢流FL荧光光谱^20,21，荧光各向异性^{（FA）22,23，}单分子FL荧光成像^24,25，和生物层干涉测量^（BLI）26也无论是不精确或适体-小分子不相容互动。其他principa这些方法升问题是灵敏度低，高样品消耗，固定化，在表面上的质量传递的限制，和/或缓冲的限制。只有少数这些技术提供了聚集和吸附作用的综合控制。

台MST表示一个强大的工具为科学家克服这种限制，研究其它靶的适体和小分子^27-29之间的相互作用，以及如蛋白质^30-33。该技术依赖于分子通过温度梯度的运动。这种定向运动，被称为“热泳，”取决于大小，电荷，并且该分子^34,35的水化外壳。配体分子的结合将直接改变这些参数中的至少一个，从而产生改变热泳迁移率。小尺寸的配体可能没有从绑定尺寸的变化对束缚态方面相当大的影响，但可以拥有博士上水合壳和/或电荷amatic影响。在分子与结合配偶体相互作用后的热泳运动的变化使得基本结合参数^2,7,34,36,37的量化。

如在图1A中所描绘的MST装置由红外激光聚焦到使用相同的光学元件作为用于荧光检测的玻璃毛细管内的试样。而激光建立温度梯度（2-6℃的ΔT）可监控的蛋白质经由色氨酸⁶或荧光标记的相互作用配偶^3,8的固有FL荧光的热泳的运动。在空间，ΔT，所产生的温度差会导致在升高的温度下的区域耗尽或分子的积累，这可通过索瑞量化系数音响cient（S _T）的 ：

G“/>

C _热表示在被加热区域的浓度，和c _冷是在初始冷区域中的浓度。

如图1B所示 ，一个典型的MST试验结果在MST运动轮廓（时间跟踪），由不同的相位，这可以通过它们各自的时间尺度来分离的。初始荧光在第一5秒中不存在温度梯度的测量来定义的精确开始荧光和检查漂白或p​​hotoenhancement。温度跳跃（T-跳转）表示相，其中热泳动前的荧光变化。荧光这个初始下降取决于uorophore量子产率FL的热依赖性变化。热泳相位如下，其中达到荧光减少（或增加），由于分子直至稳态分布的热泳运动。如在图1B中所示的激光被关闭后，可以观察到的反向TJump和FL uorescent分子伴随背面扩散。为了获得基本的绑定参数，相互作用伙伴不同的摩尔比进行了分析和比较。通常情况下，16个不同的比例进行了研究一个MST实验，而光可见分子被保持恒定，并且与未标记的配体的增加量供给。两个结合配偶之间的相互作用诱导的热泳的变化，并因此在规范化FL荧光，女_范数 ，这是因为以下计算：

˚F _热和F _冷代表在MST痕迹德科幻奈德时间点的平均荧光FL强度。结合亲和力（K _D或EC ₅₀值）可以通过CURV计算易连接（ 图1C）。

总体来看，MST是一个强大的工具来研究任何种类的分子间的相互作用。这份手稿提供了一个协议来表征小分子三磷酸腺苷（ATP 0.5 kDa的）之间的相互作用充满挑战和25-nt的单链DNA短适体DH25.42（7.9 kDa的）。在手稿的过程中，在ATP分子的适体的结合位点被映射下来到腺嘌呤基团的ATP。

Protocol

1.适体工作股票的制备遵循制造商的指示和（从基准18 5-的Cy5- CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3，序列）溶于水的寡核苷酸，达到100μM的最终浓度。 通过稀释寡库存至200nM用结合缓冲液制备的适体的工作溶液（20毫摩尔Tris，pH值7.6; 300毫摩尔NaCl; 5mM的MgCl 2的0.01％吐温20）。 孵育2分钟，混合物在90℃，让样品立即冷却在冰上，并在室温下使用的样本。 <p class="jove_title…

Representative Results

在这项研究中，MST施加以表征DH25.42的DNA适体18的结合位点上的ATP。相对于其他的研究表征的ATP或ATP的模拟与一个或更多个荧光团38-40随机标记的蛋白质的小分子的相互作用，本研究包括的7.9 kDa的单链DNA适体与一种Cy5的分子标记的版本上的5'端。不同的ATP衍生物和相关分子，都在不同的位置从ATP的不同的，分别用于映射的ATP分子的结合位点。稀释系列（在…

Discussion

质量控制：

非特异性粘着/样品材料的表面，以及聚集效应的吸附，对亲和数据的质量有巨大影响。但是，只有少数国家的最先进的技术提供准确，快速的选择，监督和避免这些影响。台MST提供了检测和帮助克服这些问题，从而允许技术设置的逐步优化集成质量控制。上粘附和荧光效果的重要信息可以从毛细管扫描和毛细管形状（步骤5.2和7.5）被提取，而聚集/沉淀的效果（步骤…

Materials

Aptamer binding buffer			20 mM Tris pH7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01%Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer	IDT, Leuven, Belgium		sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Germany	A2383	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
ADP	Sigma Aldrich, Germany	A2754	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
AMP	Sigma Aldrich, Germany	A2252	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
Adenine	Sigma Aldrich, Germany	A8626	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
SAM	Sigma Aldrich, Germany	A7007	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
dATP	Sigma Aldrich, Germany	11934511001	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
CTP	Sigma Aldrich, Germany	C1506	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
GTP	Sigma Aldrich, Germany	G8877	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies, Munich, Germany	MO-G008	Blue/Red Channel MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard	NanoTemper Technologies, Munich, Germany	MO-K002
Eppendorf PCR tubes	Eppendorf, Germany	30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device	NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1	NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2	Synergy Software