Un tumore modello murino ortotopico della vescica e del tumore Detection System

Summary

Questo protocollo descrive la generazione di tumori della vescica ortotopico murini in femmine C57BL 6J e il monitoraggio della crescita tumorale /.

Abstract

Questo protocollo descrive la generazione di tumori della vescica in topi C57BL / 6J femmina utilizzando la linea cellulare di cancro alla vescica murino MB49, che è stato modificato a secernere prostatico umano specifico (PSA), e la procedura per la conferma di impianto del tumore. In breve, i topi vengono anestetizzati con farmaci iniettabili e sono fatti per porre in posizione di dorsale. L'urina è liberata dalla vescica e 50 ml di poli-L-lisina (PLL) viene lentamente instillato ad una velocità di 10 microlitri / 20 s utilizzando un catetere 24 G IV. Si lascia in vescica per 20 min in tappatura catetere. Il catetere viene rimosso e PLL è lasciata libera entro una leggera pressione sulla vescica. Questa è seguita da instillazione della linea cellulare di cancro alla vescica murino (1 x 10 ⁵ cellule / 50 mL) ad una velocità di 10 ml / 20 s. Il catetere viene tappo per evitare evacuazione prematura. Dopo 1 h, i topi sono fatti rivivere con un farmaco inversione, e la vescica è liberate. Il tasso di instillazione lento è importante,poiché riduce il reflusso vescico-ureterale, che può causare tumori a verificarsi nel tratto urinario superiore e nei reni. La linea cellulare dovrebbe essere ben risospeso per ridurre aggregazione di cellule, come questo può portare a dimensioni tumorali irregolari dopo l'impianto.

Questa tecnica induce tumori con elevata efficienza. La crescita del tumore è monitorato da urinario secrezione di PSA. monitoraggio marcatore PSA è più affidabile di ultrasuoni o la fluorescenza per la rilevazione della presenza di tumori nella vescica. I tumori nei topi generalmente raggiungono una dimensione massima che influisce negativamente la salute di circa 3 - 4 settimane, se non trattata. Monitorando la crescita tumorale, è possibile differenziare topi che sono stati curati da quelli che non sono stati impiantati con successo con tumori. Con solo l'analisi end-point, quest'ultimo può essere erroneamente assume che sono stati curati con la terapia.

Introduction

L'obiettivo di questo metodo è quello di generare tumori della vescica murino ortotopiche e di monitorare i tumori impiantati con la massima precisione possibile, in modo che i topi senza l'impianto del tumore non è pensato per essere trattato ad analisi end-point. In generale, il metodo mostrato ridurrà la necessità di un gran numero di topi per analisi sperimentale e garantire una maggiore precisione nel determinare risultati terapeutici.

Lo sviluppo di un modello ortotopico per il cancro è importante, in quanto le cellule tumorali impiantare sottocute non ricapitolano l'ambiente della malattia clinica o consentire lo svilup....

Protocol

Tutti i lavori animale aderito alle linee guida istituzionali cura e l'uso Comitato Animal (IACUC) in uso animale di spedizione (numero di protocollo 084/12) presso l'Università Nazionale di Singapore.

1. crescita delle cellule MB49-PSA in vitro e misurazione del PSA secrezione

1. Mantenere murino di cancro della vescica cellule MB49-PSA ¹⁵ in totale Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con siero 10% fetale bovino (FBS), 2 mmol / L di L-glutammina, e 0,05 mg / ml penicillina-streptomicina in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO _2. Aggiungere 200 ug / mL Hygromycin B per m....

Results

secrezione di PSA da cellule MB49 è risultata variare con i mezzi di crescita. MB49-PSA viene coltivato in DMEM media, perché questo si traduce in un aumento della secrezione del PSA (Figura 1A). Per determinare la sensibilità del PSA ELISA e PCR in tempo reale, diverso numero di MB49-PSA-secernenti cellule sono state mescolate con cellule parentali MB49. PSA ELISA rileva un minimo di 1 x 10 ⁵ cellule secernenti PSA / 1 x 10 ⁶ cellule (Figur.......

Discussion

Le fasi più critiche nel protocollo sono 1) mantenere correttamente la tumorigenicità della linea cellulare; 2) garantire la secrezione di PSA misurabile prima dell'impianto delle cellule tumorali nei topi; 3) generare una cella singola sospensione per l'impianto in modo da ridurre la variazione della dimensione del tumore; e 4) instillare cellule a bassa velocità per evitare vescico-ureterale reflusso, con conseguente impianto di cellule tumorali nel rene.

Dopo passaggio prolungata .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellule MB49-PSA	N/A	N/A	ref (Wu QH, 2004)
RPMI 1640 media	HyClone	SH30027.01
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media	Biowest	L0102
Siero fetale bovino (FBS) South American	Biowest	S1810
Siero fetale bovino (FBS) Sud America, Premium	Biowest	S181B
Siero fetale bovino (FBS)	HyClone	SH30088.03
L-glutammina	Biowest	X0550
Penicillina-Streptomicina	Biowest	L0022
Igromicina B	Invitrogen	10687-010
libero PSA (umano) Kit ELISA Abnova		KA0209
TRIzol Reagente per l'estrazione dell'RNA	Kit	Ambion 15596026
con inibitore della RNasi	Applied Biosystems	4374967
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb	Applied Biosystems	4331182	Mm00607939_s1
TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3	Applied Biosystems	4331182	Hs00426859_g1
C57BL / 6J topi femmina	In Vivos		4 - 6 settimane vecchio
Anestesia (75 mg / kg ketamina e 1 mg / kg medetomidina)	Farmacia
Farmaco di inversione (1 mg/kg Atipamezolo)	Farmacia
Punzone per orecchio	Microscopia elettronica Scienze	72893-01
Unguento oftalmico in soluzione di Hartmann o lattato di sodio composto	B Braun
- Unguento lubrificante oculare sterile Duratears	Alcon
Heat pack - Scaldamani HotHands	Heatmax Inc
Catetere Introcan Certo IV	B Braun	4251300	24 G x 3/4″
Aquagel Gelatina lubrificante	Farmacia
Soluzione di poli-L-lisina, 0,01%,	Sigma	P4707
cOmplete, Mini, senza EDTA Inibitore della proteasi Cocktail	Roche	4693159001
Quantichrom Kit di dosaggio della creatinina Quantichrom	BioAssay Systems	DICT-50
Colorante fluorescente - VivoTrack 680	Perkin Elmer	NEV12000
Soluzione di transizione tissutale congelata RNAlater-ICE	Ambion	4427575
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Attrezzature e software
7500 Sistema PCR in tempo reale	applicato Biosystems
7500 Software v2.3	Applied Biosystems
	Tecniplast	Scaffale di tipo verticale per 12 gabbie
BD FACSCanto I system	BD Biosciences
BD FACSDiva software v7	BD Biosciences
IVIS SpectrumCT in vivo sistema di imaging	Calibro Scienze della Vita
Living Image Software v3.1	Calibro Scienze della Vita
Sistema di imaging Vevo 2100	VisualSonics