Un système de détection de tumeur modèle et tumeur murine Orthotopique vessie
Summary
Ce protocole décrit la génération de tumeurs de la vessie orthotopique de souris femelles de souris C57BL / 6J et le contrôle de la croissance tumorale.
Abstract
Ce protocole décrit la génération de tumeurs de la vessie chez des souris C57BL / 6J femelles en utilisant la lignée cellulaire de cancer de la vessie murin MB49, qui a été modifiée pour secréter de la prostate humain de l'antigène spécifique (PSA) et la procédure pour la confirmation d'implantation de la tumeur. En bref, les souris sont anesthésiés à l'aide de drogues injectables et sont faits pour mettre en position dorsale. L'urine est libérée de la vessie et de 50 pi de poly-L-lysine (PLL) est lentement instillée à un débit de 10 pl / 20 s en utilisant un cathéter 24 G IV. Il est laissé dans la vessie pendant 20 minutes en bouchant le cathéter. Le cathéter est retiré et PLL est libéré par une légère pression sur la vessie. Ceci est suivi par l' instillation de la lignée cellulaire de cancer de la vessie de souris (1 x 10 5 cellules / 50 ul) à un débit de 10 pl / 20 s. Le cathéter est bouché pour empêcher l'évacuation prématurée. Après 1 h, les souris sont ravivées avec un médicament d'inversion, et la vessie est annulée. Le taux d'instillation lente est important,car il réduit reflux vésico-urétéral, ce qui peut provoquer des tumeurs de se produire dans les voies urinaires supérieures et dans les reins. La lignée cellulaire doit être bien remis en suspension pour réduire l'agglutination des cellules, car cela peut conduire à des tailles de tumeur inégale après l'implantation.
Cette technique induit des tumeurs avec une grande efficacité. La croissance des tumeurs est contrôlée par la sécrétion urinaire de PSA. la surveillance du marqueur PSA est plus fiable que les ultrasons ou l'imagerie par fluorescence pour la détection de la présence de tumeurs de la vessie. Tumeurs chez les souris atteignent généralement une taille maximale ayant un impact négatif sur la santé d'environ 3 – 4 semaines, si non traitée. En surveillant l'évolution de la tumeur, il est possible de différencier les souris qui ont été guéris de ceux qui ne sont pas implantés avec succès des tumeurs. Avec seulement une analyse du point final, ce dernier peut être à tort, supposé avoir été guéri par thérapie.
Introduction
Le but de cette méthode est de générer des tumeurs de la vessie murin orthotopique et de suivre les tumeurs implantées aussi précisément que possible, de sorte que les souris sans implantation de la tumeur ne sont pas pensé pour avoir été durcie à l'analyse du point final. Dans l'ensemble, la méthode indiquée réduira la nécessité d'un grand nombre de souris pour l'analyse expérimentale et assurer une plus grande précision dans la détermination des résultats thérapeutiques.
Le développement d'un modèle orthotopique de cancer est important, car les cellules tumorales implantation sous-cutanée ne récapitulent pas l'environnement de la maladie clinique ou permettent le développement de stratégies thérapeutiques. L'architecture de la vessie permet à l'instillation de thérapies contre le cancer de la vessie directement dans la vessie avec des effets systémiques minimales. Ainsi, les modèles animaux qui récapitulent cet environnement, comme un modèle orthotopique, sont importantes pour évaluer de nouvelles thérapies. Les conclusions tirées de tout dispositif expérimental sont dependent sur les limites du modèle.
Plusieurs techniques ont été mises au point pour la production de tumeurs de la vessie orthotopique chez la souris. Ceux-ci se fondent sur d'endommager la couche de glycosaminoglycanes de la vessie, permettant aux cellules tumorales à implanter. Les techniques utilisées comprennent électrocoagulation, qui se traduit par un point de dégâts dans la paroi de la vessie unique, conduisant au développement de la tumeur sur un site dans la vessie 1,2. Cependant, le taux d'implantation de la tumeur à l'aide électrocoagulation de réussite est dépendante de l'opérateur variant de 10 – 90% et comprend le danger que la paroi de la vessie est percé, ce qui conduit à développer des tumeurs dans la cavité péritonéale. Cautérisation chimique est effectuée en utilisant du nitrate d' argent, ce qui endommage la paroi de la vessie 3. De même, l' acide a été utilisé pour endommager la paroi de la vessie 4. Trypsine a également été utilisé pour endommager la vessie et 5. Ces procédés peuvent entraîner l'apparition de plus d'une tumeur de la vessie.En outre, il existe un risque de dommages importants à la vessie si les produits chimiques sont laissés en contact avec la paroi de la vessie pendant trop longtemps. La méthode développée par Ninalga et al. utilise la poly-L-lysine chargée positivement (PLL) 6 molécules à recouvrir la paroi de la vessie; ce qui permet les cellules tumorales chargées négativement à coller à la couche de glycosaminoglycanes de la vessie. Ce procédé conduit généralement à plus d'une tumeur en développement dans la vessie, mais l' implantation des tumeurs est à 80 – 100% 4,7. Techniquement, il est aussi la procédure la plus simple à réaliser. Pour garantir que les tumeurs qui se développent sont assez même taille, il est important que les cellules tumorales ne sont pas regroupés dans les grandes touffes avant l'implantation.
Afin d'évaluer l'efficacité thérapeutique, il est préférable d'effectuer cette étude sur des souris avec des tumeurs assez de taille similaire. Ainsi, un système de détection qui permet de quantifier la bonne taille de la tumeur rapidement après l'implantation est importante. Plusieurs stratégies ont abeillen utilisé pour évaluer les tumeurs. Ceux – ci comprennent l' imagerie par résonance magnétique (IRM) 8-10, la fluorescence 11, bioluminescence 12,13, ultrasons 14, et le dosage immuno-enzymatique (ELISA) 15,16. Tandis que l'IRM et les ultrasons ne nécessitent pas de modifications des cellules tumorales, il existe un besoin d'un équipement et d'agents de contraste pour l'IRM sensibles. Les dosages par fluorescence, luminescence- et à base d'ELISA nécessitent une modification des cellules tumorales pour exprimer des protéines marqueurs qui peuvent être détectés par ces méthodes. Pour la fluorescence, un substrat est nécessaire pour la détection de l'activité de la luciférase; ainsi, il y a une étape supplémentaire et une augmentation des coûts. Les deux luminescence et fluorescence nécessitent un équipement spécialisé. Pour produire la fluorescence, la protéine fluorescente verte (GFP) de cyclisation qui est catalysée par l'oxygène moléculaire, est nécessaire. Ainsi, l'expression de la GFP peut être variable au sein d'une masse tumorale en fonction de l'accès à l'oxygène, ce qui en fait un marqueur peu fiable <sup> 17. Modification de la lignée de cellules de cancer de la vessie murin MB49 à sécréter de la prostate humaine Specific Antigen (PSA) 15,16 comme un marqueur de substitution est une autre stratégie. Ces marqueurs fournissent également un autre moyen de confirmer la présence d'une tumeur à la fin de l'expérience, ce qui les rend une alternative à immunohistochimie. Cette étude rapporte le procédé PLL implantation de la tumeur orthotopique et présente une comparaison des systèmes de détection d'une tumeur, à savoir la méthode ELISA, la fluorescence, l'imagerie par ultrasons.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes les plus critiques dans le protocole sont: 1) maintenir avec succès la tumorigénicité de la lignée cellulaire; 2) assurant mesurable PSA sécrétion avant l'implantation des cellules tumorales chez la souris; 3) la génération d'une suspension à cellule unique pour l'implantation de manière à réduire la variation de la taille de la tumeur; et 4) instiller des cellules à une vitesse lente pour éviter reflux vésico-urétéral, ce qui entraîne une tumeur implantation de cellules dans le…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.
Materials
| MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
| RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
| L-glutamine | Biowest | X0550 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
| free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
| TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
| TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
| C57BL/6J female mice | In Vivos | 4-6 wk old | |
| Anesthesia (75mg/kg Ketamine and 1mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
| Reversal drug (1mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
| Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
| Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
| Ophthalmic ointment – Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
| Heat pack – HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
| Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24G x 3/4″ |
| Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
| Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
| Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
| Fluorescent dye – VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
| RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| 7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
| 7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
| Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
| BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
| IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
| Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
| Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |
Riferimenti
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