מודל גידול Murine Orthotopic שלפוחית השתן סרטן מערכת איתור
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הדור של גידולים בשלפוחית השתן בעכברים orthotopic אצל נקבות עכברים C57BL / 6J ועל ניטור של הגידול.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר את הדור של גידולים בשלפוחית השתן אצל נקבות עכברים C57BL / 6J באמצעות שורת תאים סרטניים בשלפוחית השתן בעכברים MB49, אשר שונתה כדי להפריש אנטיגן ספציפי לערמונית האדם (PSA), ואת ההליך לאישור של ההשתלה הגידול. בקיצור, עכברים מורדמים באמצעות תרופות להזרקה והם עשויים להניח במצב הגבה. שתן מתפנה מן השלפוחית 50 μL של פולי- L- ליזין (PLL) הוא החדיר לאט בקצב של 10 μL / 20 שניות באמצעות קטטר 24 G IV. הוא עזב בשלפוחית במשך 20 דקות על ידי וסותם את הקטטר. צנתר מוסר PLL הוא שפונה על ידי לחץ עדין על שלפוחית השתן. זה ואחריו החדרה של הקו הסלולרי בעכברים שלפוחית השתן סרטן (1 x 10 5 תאים / 50 μL) בשיעור של 10 μL / 20 שניות. קטטר פקוק למנוע פינוי מוקדם. לאחר h 1, העכברים הם החיו עם תרופת היפוך, ואת שלפוחית השתן שהתפנה. שיעור ההחדרה האיטי חשוב,כפי שהיא מקטינה ריפלוקס vesico-השופכן, אשר יכול לגרום לגידולים להתרחש בדרכי השתן העליונות בכליות. שורת התא צריך להיות גם מחדש תלוי להפחית clumping של תאים, כמו זה יכול להוביל בגדלי גידול אחידים לאחר השתלה.
טכניקה זו גורמת גידולים עם יעילות גבוהה. צמיחת גידול מנוטרת על ידי הפרשת PSA שתן. ניטור סמן PSA הוא יותר אמין יותר מאשר אולטרסאונד או דימות פלואורסצנטי לאיתור נוכחות של גידולים בשלפוחית. גידולים בעכברים בדרך כלל להגיע לגודל מקסימאלי משפיע לרעה בריאות בכ 3 – 4 שבועות אם אינו מטופל. באמצעות מעקב אחר צמיחת הגידול, אפשר להבחין עכברים נרפאו מאלו שלא הושתלו בהצלחה עם גידולים. עם ניתוח נקודת סיום רק, זה האחרון עשוי להניח בטעות נרפא על ידי טיפול.
Introduction
המטרה של שיטה זו היא ליצור גידולים בשלפוחית שתן orthotopic murine וכן לפקח על הגידולים המושתלים באופן מדויק ככל האפשר, כך שהעכברים ללא השתלת גידול לא מיוחסים נרפאו ב ניתוח נקודת סיום. בסך הכל, השיטה לראות תפחית את צורך כמויות גדולות של עכברים לניתוח הניסיון ולהבטיח דיוק רב יותר בקביעת תוצאות טיפוליות.
פיתוח מודל orthotopic לסרטן חשוב, כמו תאים סרטניים להשתיל מתחת לעור לא לשחזר את הסביבה של מחלה קלינית או לאפשר פיתוח של אסטרטגיות טיפוליות. הארכיטקטורה של שלפוחית השתן מאפשרת ההחדרה של טיפולים בסרטן שלפוחית השתן ישירות לתוך שלפוחית השתן עם תופעות מערכתיות מינימאליות. לכן, במודלים של בעלי חיים כי לשחזר בסביבה זו, כגון מודל orthotopic, שחשובים להעריך טיפולים חדשים. מסקנות מכל ניסוי הגדרה הם dependent על מגבלות המודל.
טכניקות פותחו מספר לייצור גידולים בשלפוחית השתן orthotopic בעכברים. אלה מסתמכים על הפגיעה בשכבת glycosaminoglycan של שלפוחית השתן, מה שמאפשר לתאים נגועים להיות מושתלים. הטכניקות בשימוש כוללות electrocautery, שתוצאתה נקודה אחת של נזק לדופן השלפוחית, מה שמוביל להתפתחות גידולים באתר אחד בשלפוחית 1,2. עם זאת, שיעור ההצלחה של השתלת גידול באמצעות electrocautery הוא מפעיל תלוי הנע בין 10 – 90%, והיא כוללת את הסכנה כי לדופן השלפוחית יהיה נקב, שמובילה גידולים המתפתחים חלל הצפק. כווייה כימית מתבצעת באמצעות כסף חנק, אשר פוגע בקיר השלפוחית 3. באופן דומה, חומצה נעשה שימוש כדי לפגוע בקיר השלפוחית 4. טריפסין גם נעשה שימוש כדי לפגוע השלפוחית כמו גם 5. שיטות אלה עלולות לגרום להתפתחות של יותר מ גידול אחד בשלפוחית.יתר על כן, קיימת סכנה של נזק חמור השלפוחית אם הכימיקלים נשארים במגע עם דופן השלפוחית במשך זמן רב מדי. השיטה שפותחה על ידי Ninalga et al. משתמש פולי- L- ליזין בעלי המטען החשמלי החיובי (PLL) 6 מולקולות כדי לצפות את קיר שלפוחית השתן; זה מאפשר לתאי הגידול טעונים שלילית להיצמד שכבת glycosaminoglycan של שלפוחית השתן. שיטה זו בדרך כלל תוצאות יותר גידול אחד לפתח בשלפוחית, אך השתלת גידול היא 80 – 100% 4,7. מבחינה טכנית, זה גם ההליך הקל ביותר לבצע. כדי להבטיח כי הגידולים המתפתחים הם די אפילו בגודל, חשוב כי התאים הסרטניים אינם מקובצי גושים גדולים לפני ההשתלה.
על מנת להעריך יעילות טיפולית, עדיף לבצע מחקר זה על עכברים עם גידולים בגודל דומים למדי. לפיכך, מערכת זיהוי טובה שיכול לכמת גודל גידול קצר לאחר ההשתלה היא חשובה. יש מספר אסטרטגיות דבורהn המשמש להערכת גידולים. אלה כוללים הדמיה בתהודה מגנטית (MRI) 8-10, קרינת 11, פליטת אור 12,13, אולטרסאונד 14, ו assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) 15,16. בעוד MRI ואולטרסאונד אינו דורשים שינויים של התאים הסרטניים, יש צורך סוכני ציוד והניגודיות רגישים עבור MRI. Fluorescence-, luminescence-, המבחנים המבוססים ELISA דורשים שינוי של התאים הסרטניים לבטא חלבוני סמן שיכול להיות מזוהה על ידי שיטות אלה. לקבלת הארה, מצע נדרש לצורך זיהוי של פעילות בלוציפראז; ובכך, יש שלב מוסף התייקרות. שניהם הארת הקרינה דורשות ציוד מיוחד. כדי לייצר קרינה, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) cyclization, אשר מזורז על ידי חמצן מולקולרי, נדרש. לפיכך, ביטוי של GFP עשוי להיות משתנה בתוך מסת גידול תלוי גישת החמצן, מה שהופך את סמן למדי אמין <sup> 17. שינוי של שורת התאים בעכברי שלפוחית שתן סרטן MB49 להפריש אנטיגן ספציפי לערמונית אדם (PSA) 15,16 כסמן פונדקאי הוא אסטרטגיה אחרת. סמנים אלה גם לספק אמצעים חלופיים המאשר נוכחות גידול על סיום הניסוי, מה שהופך אותם כחלופה אימונוהיסטוכימיה. מחקר זה מדווח על שיטת PLL של השתלת גידול orthotopic ומציג השוואה של מערכות גילוי גידול, כלומר ELISA, קרינה, והדמית אולטרסאונד.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הם 1) בהצלחה שמירה על tumorigenicity של הקו הסלולרי; 2) להבטיח הפרשת PSA למדידה לפני ההשתלה תאים סרטניים בעכברים; 3) יצירת השעית תא יחיד להשתלה כדי להפחית וריאציה בגודל גידולים; ו -4) הקניית תאים בקצב איטי כדי למנוע ריפלוקס vesico-השופכן, וכתוצאה מכך ה…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.
Materials
| MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
| RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
| L-glutamine | Biowest | X0550 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
| free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
| TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
| TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
| C57BL/6J female mice | In Vivos | 4-6 wk old | |
| Anesthesia (75mg/kg Ketamine and 1mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
| Reversal drug (1mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
| Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
| Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
| Ophthalmic ointment – Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
| Heat pack – HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
| Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24G x 3/4″ |
| Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
| Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
| Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
| Fluorescent dye – VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
| RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| 7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
| 7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
| Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
| BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
| IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
| Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
| Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |
Riferimenti
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Chade, D. C., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).
- Chan, E. S., et al. Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model. J Urol. 182, 2926-2931 (2009).
- Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181 (2013).
- Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J Immunother. 28, 20-27 (2005).
- Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer. Clin Dev Immunol. , 865684 (2011).
- Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. J Urol. 145, 1297-1301 (1991).
- Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. J Urol. 170, 1375-1378 (2003).
- Sweeney, S. K., Luo, Y., O’Donnell, M. A., Assouline, J. Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles. Cancer nanotechnology. 7, 3 (2016).
- Tanaka, M., et al. Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology. J Urol. 170, 975-978 (2003).
- Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, 120-124 (2008).
- Newton, M. R., et al. Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette–Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity. Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).
- Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75, 799-804 (2010).
- Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).
- Luo, Y., Chen, X., O’Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J Urol. 172, 2414-2420 (2004).
- Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions. Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).
- Biot, C., et al. Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer. Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172 (2012).
- Swirski, F. K., et al. A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses. PLoS One. 2, 1075 (2007).
- Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal. Oncotarget. , (2016).
- Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes. J Vis Exp. , e52718 (2015).
- Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor. Academic radiology. 8, 121-127 (2001).
- Folin, O., Morris, J. L. On the determination of creatinine and creatine in urine. JBC. 17, 469-473 (1914).
- Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin. Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).
- Shi, H. W., et al. Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA. Talanta. 154, 169-174 (2016).
- Ma, H., et al. Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework. Biosensors & bioelectronics. 79, 379-385 (2016).
- Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy. Biosensors & bioelectronics. 74, 915-923 (2015).
- Lu, Y., et al. Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models. Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).
- Gong, Z., et al. Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).
