Un Cell Carcinoma Singenico modello murino di renale metastatico per quantitativo e longitudinale Valutazione della preclinici Terapie

Summary

Attuazione di un modello ortotopico di carcinoma renale nei topi immunocompetenti offre al ricercatore un sistema clinicamente rilevante definito dalla presenza di un tumore e metastasi polmonari primarie renali nello stesso animale. Questo sistema può essere utilizzato per testare preclinica una varietà di trattamenti in vivo.

Abstract

Carcinoma a cellule renali (RCC) colpisce> 60.000 persone negli Stati Uniti ogni anno, e circa il 30% dei pazienti con RCC avere più metastasi al momento della diagnosi. Metastatico RCC (CRm) è incurabile, con un tempo di sopravvivenza media di soli 18 mesi. Interventi basati immunitario (ad esempio, interferone (IFN) e interleuchina (IL) -2) inducono risposte durature in una frazione di pazienti MRCC e inibitori multichinasi (ad esempio, sunitinib o sorafenib) o anti-recettore VEGF anticorpi monoclonali (mAb) sono in gran parte palliative, come remissioni complete sono rare. Tali carenze attuali terapie per i pazienti mRCC forniscono il razionale per lo sviluppo di nuovi protocolli di trattamento. Un componente chiave nella sperimentazione preclinica di nuove terapie per mRCC è un modello animale adatto. caratteristiche benefiche che ricapitolano la condizione umana includono un tumore primario renale, metastasi tumorali renali, e un sistema immunitario intatto per indagare su qualsiasi Effecto immunitario terapia-drivenr risposte e la formazione di fattori immunosoppressivi tumore-indotta. Questo rapporto descrive un modello di topo mRCC ortotopico che ha tutte queste caratteristiche. Descriviamo una tecnica di impiantazione intrarenali usando il mouse renale linea cellulare di adenocarcinoma Renca, seguita dalla valutazione della crescita del tumore nel rene (sito principale) e polmoni (sito metastatico).

Introduction

Carcinoma a cellule renali (RCC) rappresenta la maggior parte delle neoplasie maligne del rene e circa il 3% di tutti i tumori maligni adulti in tutto il mondo ^{1, 2.} A causa della mancanza di sintomi, diagnosi errata, e strumenti di screening insufficienti per RCC, quasi il 30% dei pazienti presenterà con metastatico RCC (CRm) al momento della diagnosi, con un ulteriore 20-30% dei pazienti con progressione di stadio metastatico ^2. Questi casi si traducono in ~ 13.500 decessi ogni anno ^{1, 3.} Anche se in precedenza il rilevamento e il trattamento di primaria RCC è migliorata, il tasso di morte RCC legati continua ad aumentare, il che suggerisce che la malattia metastatica è in gran parte responsabile per la mortalità ^3. dello sviluppo di terapie per il carcinoma renale è progredita negli ultimi dieci anni con la scoperta e l'attuazione di terapie e immunoterapie mirate. Purtroppo, survivability libera da progressioneAl e sopravvivenza complessiva dei casi avanzati sono ancora ben inferiore a 2 anni per la maggior parte dei pazienti ^{4, 5, 6.} Queste statistiche giustificano la necessità di ulteriori ricerche per l'individuazione e lo sviluppo di trattamenti efficaci per RCC. Per avanzare adeguatamente interventi terapeutici per il carcinoma renale metastatico, in primo luogo sono necessari translationally rilevanti modelli pre-clinici della malattia.

Sviluppo di un modello pertinente e coerente per ricapitolare la condizione umana di carcinoma renale avanzato dovrebbe affrontare diverse questioni chiave: 1) è il modello anatomicamente rilevanti; 2) Se lo stato di avanzamento del tumore in modo simile alla patologia umana; 3) fare metastasi derivano dal tumore primario; e 4) Può la progressione del tumore primario e metastasi essere monitorato nel tempo? A seconda del tipo di trattamento in fase di studio, linee topo RCC tumorali cellulari, linee cellulari tumorali umane RCC e RCC xenog paziente umano derivatozattere possono essere utilizzati in topi immunocompetenti e immunodeficienti. È necessaria una host con un sistema immunitario intatto e funzionale per quegli studi che valutano alcuni aspetti di immunoterapia, rendendo necessario l'uso della linea cellulare Renca ben descritto derivata da un adenocarcinoma renale spontanea di Balb topi / c ^7. Molti studi iniettano cellule Renca sottocutanea (sc), che forma un tumore locale facile da misurare, o per via endovenosa (iv) in topi Balb / c per produrre sperimentali polmone "metastasi" ^{8, 9, 10, 11, 12.} Uso di un tumore Renca sc-impiantato per modellare RCC umano ha un numero di limitazioni, tra cui innervazione imprecisa di vascolarizzazione ^13, differenze di microambiente ^{14, 15,} e la mancanza di organo / tumore communic cellularezione ^{13, 16.} Inoltre, molti tumori sc (soprattutto Renca) non metastatizzano agli organi distali, inibendo lo studio di un evento che è una comune caratteristica clinica ^17. Per studiare mRCC, cellule Renca possono essere iniettati iv stabilire carico tumorale nei polmoni, la località principale di metastasi nei pazienti RCC. Il metodo di iniezione iv di autoinnesco tumori metastatici, tuttavia, non consente lo studio di come, quando, o perché le cellule sono migrati dall'organo primaria (cioè, il rene) al sito distante. Un modello con entrambe le malattie primari e metastatici evidente nello stesso animale è fondamentale per studiare la progressione e trattamento della malattia avanzata, soprattutto se si considera che le metastasi sono tipicamente la causa di mortalità in questi pazienti.

Il nostro laboratorio ha sviluppato un modello murino di carcinoma renale metastatico che incorpora tutte le caratteristiche di cui sopra. Per stabilire primary, tumori ortotopico, cellule Renca vengono impiantate direttamente nel rene dell'animale attraverso il peritoneo traslucido. Una piccola incisione nel fianco sinistro permette la visualizzazione della milza (come punto di riferimento) e rene sinistro. Utilizzando un ago di piccolo calibro, le cellule tumorali Renca vengono iniettati direttamente nel rene attraverso il peritoneo per l'impianto ortotopico. Rispetto ad altri metodi di impiantare cellule Renca sotto la capsula renale ^18, questo metodo di impiantazione consente una produttività più elevata, come è abbastanza non invasivo, non richiede sutura, è di una classe dolore bassa, ed è tempo efficiente quando praticata.

Questo ben caratterizzati risultati del modello a carico riproducibili primaria del tumore (~ 99% tasso di utilizzo) nel rene iniettato così come il carico tumorale metastatico nei polmoni. I vantaggi significativi di questo modello includono la sua natura singenici, permettendo per le indagini di immunoterapia; le sue metastasi spontanee, di studiare unmalattie dvanced; e il suo impianto ortotopico, per modellare l'impatto anatomica sulla progressione della malattia e il trattamento. Terapie mirate a colpire RCC sarebbe di grande beneficio dall'utilizzo di questo modello durante lo sviluppo preclinico.

Protocol

Il seguente protocollo descrive una procedura sperimentale per indurre e monitoraggio della crescita dei tumori renali ortotopiche sperimentali ed eventuali metastasi spontanee. Tutte le seguenti procedure vengono eseguite in conformità con le politiche istituzionali e le procedure approvate per quanto riguarda l'uso umano degli animali da esperimento. 1. Manutenzione di linee cellulari Mantenere murino linea cellulare di adenocarcinoma renale, Renca, in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 164…

Representative Results

L'impianto di successo delle cellule Renca si tradurrà nello sviluppo del tumore nel rene e metastasi ai polmoni dei topi. Dopo l'asportazione del tumore-cuscinetto e reni controlaterali, pesi tessuto bagnato (g) sono stati misurati per dimostrare la massa tumorale basata su un maggior peso (Figura 1). Tumori Renca possono essere identificati mediante immunoistochimica attraverso citocheratina 8 e 18 colorazione (Figura 2). Per gli studi l…

Discussion

Vi presentiamo un protocollo per un modello di topo RCC ortotopico. L'impianto di cellule tumorali adenocarcinoma renale del mouse nel rene del mouse fornisce un modello clinicamente rilevanti di carcinoma renale metastatico. Questo modello si traduce in un tumore primario all'interno del rene e metastasi a distanza nei polmoni, che sono entrambi tratti distintivi di carcinoma renale avanzato. La descrizione qui presentata è specifico per la linea cellulare Renca nel immunocompetenti topi BALB / c. Utilizzando …

Materials

Artificial tears ophthalmic ointment	Akorn	NDC 17478-162-35
Vetbond Tissue Adhesive	3M	CBGBIW011019
Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%)	Purdue Products, L.P.	NDC 67618-155-32
0.25% Marcaine (bupivavaine HCL injection)	Hospira	0409-1587-50
Heating pad	Sunbeam
Syringes	BD	309659
Gauze	Venture	908291
Ketamine	Phoenix Pharmaceuticals	NDC 57319-609-02
Xylazine	Akorn	NDC 59399-111
Hank’s Balanced Salts	Sigma-Aldrich	H2387
IVIS	Caliper
D-Luciferin, Potassium Salt	GoldBio	LUCK-1G
India Ink	Chartpak Inc	44201
Scissors
Forceps
Sleeping Beauty (SB) transposon system	Neuromics	SBT0200
Renca	ATCC	CRL-2947