En syngene mus modell av metastatisk nyrecellekarsinom for Kvantitativ og Langsgående vurdering av Prekliniske terapier

Summary

Gjennomføring av en ortotopisk modell av nyrecellekarsinom i immunokompetente mus gir utprøver en klinisk relevant system definert ved nærværet av en primær nyretumor og lungemetastaser i det samme dyr. Dette systemet kan brukes til å teste preklinisk en rekke behandlinger in vivo.

Abstract

Nyrecellekarsinom (RCC) påvirker> 60.000 mennesker i USA hvert år, og ~ 30% av RCC pasienter har flere metastaser på diagnosetidspunktet. Metastatisk RCC (mRCC) er uhelbredelig, med en median overlevelsestid på kun 18 måneder. Immun-basert behandling (f.eks, interferon (IFN) og interleukin (IL) -2) induserer vedvarende responser i en brøkdel av mRCC pasienter, og multikinasehemmer inhibitorer (f.eks sunitinib eller sorafenib) eller anti-VEGF-reseptor, monoklonale antistoffer (mAb) er i stor grad palliativ, som komplette remisjoner er sjeldne. Slike mangler ved eksisterende terapier for mRCC pasienter gi begrunnelsen for utviklingen av nye behandlingsprotokoller. En nøkkelkomponent i den prekliniske testing av nye terapier for mRCC er en egnet dyremodell. Fordelaktige trekk at rekapitulere den menneskelige tilstand inkluderer en primær nyretumor, nyretumormetastaser, og et intakt immunsystem for å undersøke enhver terapi-drevet immun Effector reaksjoner og dannelsen av tumor-indusert immunsuppressive faktorer. Denne rapporten beskriver en orthotopic mRCC mus modell som har alle disse funksjonene. Vi beskriver en intrarenal implantering teknikk ved å bruke musen renal adenocarcinoma cellelinje Renca, etterfulgt av vurdering av tumorvekst i nyrene (primær-området), og lungene (metastatisk site).

Introduction

Nyrecellekarsinom (RCC) står for majoriteten av ondartede nyre svulster og omtrent 3% av alle voksne maligniteter verdensomspennende ^{1, 2.} På grunn av mangel av symptomer, feildiagnoser og utilstrekkelig screening verktøy for RCC, vil nesten 30% av pasienter med metastatisk RCC frem (mRCC) på diagnosetidspunktet, med en ytterligere 20-30% av pasientene utvikler seg til en metastatisk trinn ^2. Disse tilfellene føre til ~ 13.500 dødsfall årlig ^{en, 3.} Selv om tidligere oppdagelse og behandling av primær RCC har blitt bedre, frekvensen av RCC-dødsfall fortsetter å øke, noe som tyder på at metastatisk sykdom er i stor grad ansvarlig for dødelighet ^tre. Terapi utvikling for RCC har kommet i løpet av det siste tiåret med oppdagelsen og gjennomføring av målrettet terapi og immunterapi. Dessverre, progresjonsfri survival og total overlevelse av fremskredne tilfeller fremdeles er godt under 2 år for de fleste pasientene ^{4, 5, 6.} Denne statistikken tilsier behov for videre forskning på identifisering og utvikling av effektive behandlinger for RCC. For å fremme adekvat terapeutisk intervensjon for mRCC, er translatorisk-relevante prekliniske modeller av sykdommen først nødvendig.

Utvikling av en relevant og konsistent modell for å rekapitulere den menneskelige tilstand av avansert RCC bør ta flere viktige spørsmål: 1) Er modellen anatomisk relevant; 2) gjør svulsten fremskritt på samme måte som den menneskelige patologi; 3) Gjør metastaser oppstår fra den primære svulsten; og 4) kan primær og metastatisk tumorprogresjon overvåkes over tid? Avhengig av hvilken type behandling som skal undersøkes, mus RCC tumorcellelinjer, humane RCC-tumorcellelinjer og humane RCC pasient-avledet xenogflåter kan anvendes i immunundertrykte eller immunmang mus. En vert med en intakt og funksjonelt immunsystem er nødvendig for de studier som evaluerte noen aspekter av immunterapi, nødvendiggjør bruk av den vel beskrevne Renca cellelinje avledet fra en spontan renal adenocarcinoma fra Balb / c-mus ^7. De fleste studier injisere Renca celler subkutant (SC), som danner en lett-å-måle lokal tumor eller intravenøst (iv) i Balb / c-mus for å fremstille eksperimentell lungemetastaser "" ^{8, 9, 10, 11, 12.} Anvendelse av en sc-implantert Renca tumor for å modellere human RCC har en rekke begrensninger, blant annet unøyaktig innervasjon av vaskulatur ^13, forskjeller i mikromiljøet ^{14, 15,} og en manglende organ / tumor cellulær kommunikasjon;asjon ^{13, 16.} I tillegg er det mange sc-tumorer (spesielt Renca) ikke metastasere til fjerntliggende organer, inhibering studiet av en hendelse som er et vanlig klinisk karakteristisk ^17. For å studere mRCC kan Renca celler injiseres iv å etablere tumorbelastning i lungene-den primære lokaliseringen av metastaser i RCC-pasienter. Den iv injeksjon metode for initiering av metastatiske tumorer, men ikke tillater undersøkelse av hvordan, når, eller hvorfor cellene har migrert fra den primære organ (dvs. nyren) til den fjerntliggende sted. En modell med både primær og metastatisk sykdom tydelig i det samme dyr er avgjørende for å studere utviklingen og behandling av fremskreden sykdom, spesielt med tanke på at metastaser er vanligvis årsak til dødelighet i disse pasientene.

Vårt laboratorium har utviklet en musemodell for mRCC som inkorporerer alle de funksjonene som er skissert ovenfor. Å etablere primary, ortotopiske tumorer, blir Renca celler implantert rett inn i nyrene av dyret gjennom den gjennomskinnelige peritoneum. Et lite snitt i den venstre flanke tillater visualisering av milt (som et fjell), og den venstre nyre. Ved hjelp av en liten nål, blir Renca tumorceller injisert direkte inn i nyrene inn i peritoneum til ortotopisk implantasjon. Sammenlignet med andre fremgangsmåter for implantering av Renca celler under nyrekapselen ^18, denne metoden for implantasjon tillater en større gjennomstrømning, slik det er ganske ikke-invasiv, krever ikke suturering, er av en lav smerte klasse, og er tidsbesparende når praktiseres.

Dette velkarakteriserte modell gir reproduserbare primær tumorbyrden (~ 99% foretar rate) i den injiserte nyrene, så vel som metastatisk tumorbelastning i lungene. De viktigste fordelene med denne modellen inkluderer dens syngen natur, noe som åpner for immunterapi undersøkelser; sine spontane metastaser, for å studere ene avansert sykdom; og dens ortotopisk implantasjon, for å modellere den anatomiske innvirkning på sykdomsprogresjon og behandling. Behandlinger som tar sikte på å målrette RCC vil ha stor nytte av utnyttelse av denne modellen under preklinisk utvikling.

Protocol

Følgende protokoll beskrives en eksperimentell prosedyre for å indusere og overvåke veksten av eksperimentelle ortotopiske renale tumorer og eventuelle spontane metastaser. Alle de følgende prosedyrene er gjort i henhold til institusjonelle retningslinjer og godkjente prosedyrer vedrørende human bruk av forsøksdyr. 1. Vedlikehold av cellelinjer Oppretthold murine renal adenocarcinoma cellelinje, Renca, i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS)…

Representative Results

Den vellykkede implantering av Renca celler vil resultere i tumorutvikling i nyrene og metastasering til lungene hos musene. Etter fjerning av tumoren bærende og de kontralaterale nyrer, ble anvendt våte vev vekter (g) måles for å påvise tumorbelastningen på grunnlag av økt vekt (figur 1). Renca tumorer kan identifiseres ved immunhistokjemi gjennom cytokeratin 8 og 18 farging (figur 2). For longitudinelle studier, ble en luciferase-uttrykken…

Discussion

Vi presenterer en protokoll for en ortotopisk RCC musemodell. Implantasjon av musenyre adenokarsinom tumorceller inn i musenyre har en klinisk relevant modell av mRCC. Denne modellen resulterer i en primær tumor i nyre og fjernmetastaser i lungene, som begge er kjennetegnene til avansert RCC. Den beskrivelse som presenteres her er spesifikk for den Renca cellelinje hos immunkompetente Balb / c-mus. Ved hjelp av denne ortotopisk modell, har vi vist at Renca svulster er mottakelig for immunterapi, noe som viser anvendbar…

Materials

Artificial tears ophthalmic ointment	Akorn	NDC 17478-162-35
Vetbond Tissue Adhesive	3M	CBGBIW011019
Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%)	Purdue Products, L.P.	NDC 67618-155-32
0.25% Marcaine (bupivavaine HCL injection)	Hospira	0409-1587-50
Heating pad	Sunbeam
Syringes	BD	309659
Gauze	Venture	908291
Ketamine	Phoenix Pharmaceuticals	NDC 57319-609-02
Xylazine	Akorn	NDC 59399-111
Hank’s Balanced Salts	Sigma-Aldrich	H2387
IVIS	Caliper
D-Luciferin, Potassium Salt	GoldBio	LUCK-1G
India Ink	Chartpak Inc	44201
Scissors
Forceps
Sleeping Beauty (SB) transposon system	Neuromics	SBT0200
Renca	ATCC	CRL-2947