Ячейка Карцинома Сингенной Мышь Модели метастатического Почечной для количественных и Продольных оценок доклинических Терапии
Summary
Осуществление ортотопической модели почечно-клеточной карциномы в иммунокомпетентных мышах дает следователю клинически-соответствующую систему, определяемую наличием первичной опухоли почки и метастазов в легких в том же животном. Эта система может быть использована для доклинического тестирования различных методов лечения в естественных условиях.
Abstract
Почечно-клеточный рак (ПКР) влияет на> 60000 человек в Соединенных Штатах ежегодно, и ~ 30% больных ПКР имеют множественные метастазы на момент постановки диагноза. Метастатического ПКР (МСКЦ) неизлечим, медиана выживаемости всего 18 месяцев. Иммунные на основе вмешательства (например, интерферон (IFN) и интерлейкин (ИЛ) -2) вызывают длительные реакции у части пациентов MRCC и мультикиназный ингибиторы (например, сунитиниба или сорафениб) или анти-VEGF – рецептор моноклональные антитела (MAB) являются в значительной степени паллиативный, а полные ремиссии редки. Такие недостатки в современной терапии для пациентов MRCC обеспечивают обоснование для разработки новых протоколов лечения. Ключевой компонент в доклинических испытаниях новых методов лечения MRCC является подходящей моделью для животных. Полезные функции, которые перепросматривать человеческое состояние включают первичную опухоль почек, почечный метастаз опухолей, а также интактную иммунную систему, чтобы исследовать любую терапию управляемого иммунные эффекторнымг реакция и образование опухоли, вызванные иммуносупрессивных факторов. Этот отчет описывает ортотопическую мышиную модель MRCC, которая имеет все эти функции. Опишем внутрипочечный технику имплантации с помощью мыши почечной аденокарциномы клеточной линии Ренка, а затем оценки роста опухоли в почках (основной сайт) и легких (метастатическим сайт).
Introduction
Почечный – клеточный рак (ПКР) составляет для большинства злокачественных новообразований почек и примерно 3% от всех злокачественных новообразований у взрослых во всем мире 1, 2. Из – за отсутствия симптомов, неправильного диагноза, и недостаточные инструменты скрининга для РКС, почти у 30% пациентов будут представлены с метастатическим ПКР (MRCC) на момент постановки диагноза, с дополнительным 20-30% пациентов , прогрессирующих до метастатической стадии 2. Эти случаи приводят к ~ 13500 смертей в год 1, 3. Хотя ранее обнаружение и лечение первичного RCC улучшилось, скорость РКС-связанной смерти продолжает расти, предполагая , что метастатическое заболевание в значительной степени ответственны за смертностью 3. Развитие терапии ПКР прогрессировало в течение последнего десятилетия с открытием и реализацией целевых методов лечения и иммунотерапии. К сожалению, без прогрессирования survivаль и общая выживаемость запущенных случаев все еще хорошо в 2 -х года для большинства пациентов 4, 5, 6. Эти статистические данные говорят о необходимости дальнейших исследований в выявлении и разработке эффективных методов лечения ПКР. Для адекватного продвижения терапевтических вмешательств для MRCC, сначала необходимо поступательно-соответствующие доклинические модели заболевания.
Разработка соответствующей и последовательная модели резюмировать человеческое состояние передового RCC должен решить несколько ключевых вопросов: 1) Является ли модель анатомический отношением; 2) Есть ли прогресс опухоли по аналогии с человеческой патологии; 3) Есть ли метастазы возникают из первичной опухоли; и 4) Может прогрессирование первичного и метастатического опухолевого контролироваться с течением времени? В зависимости от типа лечения исследуется, линии опухолевых клеток мыши РКЦ, линии человеческих опухолевых клеток РКЦ и человека RCC пациента, полученных xenogплоты могут быть использованы в иммунокомпетентных или иммунодефицитных мышей. Хост с интактным и функциональной иммунной системы требуется для этих исследований , оценивающих некоторые аспекты иммунотерапии, что требует использования хорошо описанной клеточной линии , полученной из Ренка спонтанной почечной аденокарциномы BALB / C мышей 7. Большинство исследований впрыснуть Ренок клетки подкожно (SC), который образует простую в меру локальной опухоль, или внутривенно (IV) в мышей BALB / C для получения экспериментальных легких «метастазов» 8, 9, 10, 11, 12. Пользование подкожно имплантированных опухолей Ренка к модели человеческого РКЦ имеет ряд ограничений, в том числе неточной иннервации сосудов 13, различия в микросреде 14, 15, а также отсутствие органа / опухоли сотовой COMMUNICция 13, 16. Кроме того, многие SC опухоли (особенно Ренок) не метастазируют в дистальные органы, ингибируя исследование о событии , которое является общим клинической характеристикой 17. Для изучения MRCC, Ренка клетки могут быть введены внутривенно, чтобы установить бремя опухоли в легких-первичном месте метастазов у больных РСС. IV инъекционный метод инициирования метастатических опухолей, однако, не позволяет исследовать , как, когда и почему клетки мигрировали из первичного органа (т.е. почки) в отдаленном месте. Модель с первичным и метастатическим заболеванием очевидным в том же животном имеет решающее значение для изучения прогрессирования и лечения позднего стадии заболевания, особенно с учетом того, что метастазы обычно являются причиной смертности у этих пациентов.
Наша лаборатория разработала мышиную модель MRCC, которая включает в себя все функции, изложенные выше. Чтобы установить прimary, ортотопическая опухоль, клетки Ренка имплантирует непосредственно в почки животного через полупрозрачные брюшины. Небольшой разрез в левом боке позволяет для визуализации селезенки (как ориентир) и левой почки. С помощью небольшой иглы калибра, опухолевые клетки RENCA вводят непосредственно в почку через брюшину для ортотопической имплантации. По сравнению с другими методами имплантации клеток Ренка ниже капсулы 18 почек, этот способ имплантации обеспечивает более высокую пропускную способность , так как это довольно неинвазивным, не требует наложения швов, имеет низкий класс боли, а также занимает много времени эффективным , когда практикуется.
Это хорошо охарактеризованы результаты модели в воспроизводимом бремени первичной опухоли (~ 99% скорости отбора) в впрыскиваемого почек, а также метастатической опухолевой нагрузки в легких. Существенные преимущества этой модели включают его сингенный характер, что позволяет иммунотерапии исследованиям; его спонтанные метастазы, изучатьdvanced болезнь; и его ортотопическая имплантация, смоделировать анатомическое влияние на прогрессировании заболеваний и лечение. Методы лечения, направленные на нацеливание RCC бы извлечь большую пользу от использования этой модели в ходе доклинических развития.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представляем протокол для ортотопической мышиной модели РКЦ. Имплантация мыши почечных опухолевых клеток аденокарциномы в почки мыши, обеспечивает клинически соответствующую модель MRCC. Эта модель приводит к первичной опухоли в почках и отдаленных метастазов в легких, оба из котор…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Национального института рака (R15CA173657 к AW и R01CA109446 к TSG), Института рака (Simmons к AW) и Университета Minnestoa Подняться 4 рака почки Foundation (для TSG). Мы благодарим д-ра Кристин Андерсон за помощь в иммунофлюоресценции.
Materials
| Artificial tears ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-162-35 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | CBGBIW011019 | |
| Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%) | Purdue Products, L.P. | NDC 67618-155-32 | |
| 0.25% Marcaine (bupivavaine HCL injection) | Hospira | 0409-1587-50 | |
| Heating pad | Sunbeam | ||
| Syringes | BD | 309659 | |
| Gauze | Venture | 908291 | |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | NDC 57319-609-02 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-111 | |
| Hank’s Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| IVIS | Caliper | ||
| D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | |
| India Ink | Chartpak Inc | 44201 | |
| Scissors | |||
| Forceps | |||
| Sleeping Beauty (SB) transposon system | Neuromics | SBT0200 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 |
Riferimenti
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 66, 7-30 (2016).
- Chow, W. H., Dong, L. M., Devesa, S. S. Epidemiology and risk factors for kidney cancer. Nat. Rev. Urol. 7, 245-257 (2010).
- Hollingsworth, J. M., Miller, D. C., Daignault, S., Hollenbeck, B. K. Rising incidence of small renal masses: a need to reassess treatment effect. J. Natl. Cancer Inst. 98, 1331-1334 (2006).
- Lee-Ying, R., Lester, R., Heng, D. Current management and future perspectives of metastatic renal cell carcinoma. Int. J. Urol. 21, 847-855 (2014).
- Rini, B. I. New strategies in kidney cancer: therapeutic advances through understanding the molecular basis of response and resistance. Clin. Cancer Res. 16, 1348-1354 (2010).
- Acquavella, N., Fojo, T. Renal cell carcinoma: trying but failing to improve the only curative therapy. J. Immunother. 36, 459-461 (2013).
- Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Cancer Res. 46, 3358-3363 (1986).
- Ko, J. S., et al. Direct and differential suppression of myeloid-derived suppressor cell subsets by sunitinib is compartmentally constrained. Cancer Res. 70, 3526-3536 (2010).
- Kusmartsev, S., et al. Oxidative stress regulates expression of VEGFR1 in myeloid cells: link to tumor-induced immune suppression in renal cell carcinoma. J. Immunol. 181, 346-353 (2008).
- Rocha, F. G., et al. Endostatin gene therapy enhances the efficacy of IL-2 in suppressing metastatic renal cell carcinoma in mice. Cancer Immunol. Immunother. 59, 1357-1365 (2010).
- Shanker, A., et al. Treating metastatic solid tumors with bortezomib and a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonist antibody. J. Natl. Cancer Inst. 100, 649-662 (2008).
- VanOosten, R. L., Griffith, T. S. Activation of tumor-specific CD8+ T Cells after intratumoral Ad5-TRAIL/CpG oligodeoxynucleotide combination therapy. Cancer Res. 67, 11980-11990 (2007).
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages. Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).
- Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Mol. Ther. 22, 18-27 (2014).
- Devaud, C., et al. Differential potency of regulatory T cell-mediated immunosuppression in kidney tumors compared to subcutaneous tumors. Oncoimmunology. 3, 963395 (2014).
- Devaud, C., et al. Cross-talk between tumors can affect responses to therapy. Oncoimmunology. 4, 975572 (2015).
- Norian, L. A., et al. Eradication of metastatic renal cell carcinoma after adenovirus-encoded TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)/CpG immunotherapy. PLoS One. 7, 31085 (2012).
- Matin, S. F., et al. Immunological response to renal cryoablation in an in vivo orthotopic renal cell carcinoma murine model. J. Urol. 183, 333-338 (2010).
- Wilber, A., et al. RNA as a source of transposase for Sleeping Beauty-mediated gene insertion and expression in somatic cells and tissues. Mol. Ther. 13, 625-630 (2006).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J. Vis. Exp. , (2009).
- Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. , (2013).
- Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse. J. Vis. Exp. , (2010).
- Wexler, H. Accurate identification of experimental pulmonary metastases. J. Natl. Cancer Inst. 36, 641-645 (1966).
- James, B. R., et al. CpG-mediated modulation of MDSC contributes to the efficacy of Ad5-TRAIL therapy against renal cell carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 63, 1213-1227 (2014).
- James, B. R., Brincks, E. L., Kucaba, T. A., Boon, L., Griffith, T. S. Effective TRAIL-based immunotherapy requires both plasmacytoid and CD8a DC. Cancer Immunol. Immunother. 63, 685-697 (2014).
- James, B. R., et al. Diet-induced obesity alters dendritic cell function in the presence and absence of tumor growth. J. Immunol. 189, 1311-1321 (2012).
- Brincks, E. L., et al. Triptolide enhances the tumoricidal activity of TRAIL against renal cell carcinoma. FEBS J. 282, 4747-4765 (2015).
- Anderson, K. G., et al. Cutting edge: intravascular staining redefines lung CD8 T cell responses. J. Immunol. 189, 2702-2706 (2012).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat. Protocols. 9, 209-222 (2014).
