Ett syngent musmodell av metastaserad njurcellscancer för kvantitativ och Longitudinal Bedömning av Prekliniska terapier

Summary

Genomförande av en ortotopisk modell av njurcellscancer i immunkompetenta möss ger utredaren en kliniskt relevanta system definieras av närvaron av en primär njurtumör och lungmetastaser i samma djur. Detta system kan användas för att prekliniskt testa en mängd olika behandlingar in vivo.

Abstract

Njurcellscancer (RCC) drabbar> 60.000 människor i USA varje år, och ~ 30% av RCC-patienter har flera metastaser vid tidpunkten för diagnos. Metastaserande RCC (mRCC) är obotlig, med en medianöverlevnadstid av endast 18 månader. Immunbaserade interventioner (t ex interferon (IFN) och interleukin (IL) -2) inducerar varaktiga responser i en fraktion av MRCC patienter och multikinashämmare (t.ex. sunitinib eller sorafenib) eller anti-VEGF-receptor monoklonala antikroppar (mAb) är till stor del palliativ som kompletta remission är sällsynta. Sådana brister i nuvarande terapier för MRCC patienter ger den logiska grunden för utveckling av nya behandlingsprotokoll. En nyckelkomponent i den prekliniska testning av nya terapier för mRCC är en lämplig djurmodell. Nyttiga funktioner som rekapitulera människans villkor inkluderar en primär njurtumör, njurtumörmetastaser, och ett intakt immunsystem för att undersöka någon terapi driven immun effector svar och bildningen av tumörframkallad immunosuppressiva faktorer. Denna rapport beskriver en orthotopic mRCC musmodell som har alla dessa egenskaper. Vi beskriver en intrarenal implanteringstekniken genom att använda musen renal adenokarcinom cellinje Renca, följt av bedömning av tumörtillväxt i njuren (primärt ställe) och lungorna (metastatisk språk).

Introduction

Njurcellskarcinom (RCC) står för huvuddelen av maligna njur neoplasmer och ungefär 3% av alla vuxna maligniteter världen över ^{ett, två.} Grund av brist på symptom, fel diagnos, och otillräckliga screening verktyg för RCC, kommer nästan 30% av patienterna presentera med metastaserad RCC (mRCC) vid tidpunkten för diagnos, med ytterligare 20-30% av patienterna som fortskrider till en metastatisk stadium ^två. Dessa fall resulterar i ~ 13.500 dödsfall årligen ^{1, 3.} Även om tidigare upptäckt och behandling av primär RCC har förbättrats, hastigheten för RCC relaterat dödsfall fortsätter att öka, vilket antyder att metastatisk sjukdom är till stor del ansvarig för dödlighet ^3. Terapi utveckling för RCC har utvecklats under det senaste decenniet med upptäckten och genomförande av riktade behandlingar och immunterapi. Tyvärr progressionsfri survival och total överlevnad av avancerade fall är fortfarande väl under 2 år för majoriteten av patienterna ^{4, 5, 6.} Denna statistik motiverar behovet av ytterligare forskning om identifiering och utveckling av effektiva behandlingar för RCC. Att på lämpligt sätt föra terapeutiska ingrepp för MRCC först behövs translationellt relevanta prekliniska modeller av sjukdomen.

Utveckling av en relevant och konsekvent modell för att rekapitulera det mänskliga tillståndet av avancerad RCC bör ta itu med flera viktiga frågor: 1) är den modell anatomiskt relevant; 2) Har tumör framsteg på liknande sätt som den humana patologin; 3) Gör metastaser uppstår från den primära tumören; och 4) Kan primär och metastatisk tumörprogression följas över tid? Beroende på vilken typ av behandling som undersöks, mus RCC tumörcellinjer, humana RCC tumörcellinjer och humana RCC patienten härledda xenogflottar kan användas i immunkompetenta eller immundefekta möss. En värd med ett intakt och funktionellt immunsystem krävs för de studier som utvärderar någon aspekt av immunterapi, nödvändiggör användning av den väl beskrivna Renca cellinje härledd från en spontan renal adenokarcinom i Balb / c-möss ^7. De flesta studier injicera RENCA-celler subkutant (sc), som bildar en enkel att mått lokal tumör eller intravenöst (iv) i Balb / c-möss för att producera experimentella lung "metastaser" ^{8, 9, 10, 11, 12.} Användning av en sc-implanterat Renca tumör för att modellera humana RCC har ett antal begränsningar, inklusive felaktig innervation av vaskulatur ^13, skillnader i mikromiljö ^{14, 15,} och en brist av organ- / tumörcell Communication ^{13, 16.} Dessutom är det många sc tumörer (särskilt Renca) inte metastasera till distala organ, hämmar studiet av en händelse som är ett vanligt kliniskt kännetecken ^17. Att studera MRCC kan RENCA-celler injiceras iv att etablera tumörbördan i lungorna, den primära platsen för metastaser i RCC patienter. Iv-injektion metod att initiera metastatiska tumörer, dock inte tillåter undersökning av hur, när, eller varför cellerna har migrerat från den primära organet (dvs njure) till den avlägsna platsen. En modell med både primära och metastatisk sjukdom tydligt i samma djur är avgörande för att studera utvecklingen och behandling av framskriden sjukdom, särskilt med tanke på att metastaser är vanligen orsaken till dödlighet hos dessa patienter.

Vårt laboratorium har utvecklat en musmodell av mRCC som innehåller alla de funktioner som beskrivs ovan. Att etablera primary, ortotopiska tumörer, är Renca celler implanteras direkt i njuren hos djuret genom den genomskinliga bukhinnan. Ett litet snitt i den vänstra flanken möjliggör visualisering av mjälten (som ett landmärke) och den vänstra njuren. Med användning av en liten nål, är Renca-tumörceller injiceras direkt i njuren genom peritoneum för orthotopic implantation. Jämfört med andra metoder för implantering av RENCA-celler under njurkapseln ^18, denna metod för implantering tillåter en högre genomströmning, eftersom det är ganska icke-invasiv, inte kräver suturering, är av en låg smärt klass, och är tidseffektivt när tränad.

Denna väl karaktäriserade modellresultat i reproducerbar primär tumörbörda (~ 99% utnyttjandegrad) i den injicerade njuren samt metastatisk tumörbelastning i lungorna. De stora fördelarna med denna modell inkluderar dess syngena natur, vilket möjliggör immunterapi undersökningar; dess spontana metastaser, att studera ettVANCERADE sjukdom; och dess orthotopic implantation, för att modellera den anatomiska inverkan på sjukdomsförloppet och behandling. Terapier som syftar till att rikta RCC skulle ha stor nytta av användningen av denna modell under preklinisk utveckling.

Protocol

Följande protokoll beskriver ett experimentellt förfarande för inducering och övervakning av tillväxten av experimentella ortotopiska njurtumörer och eventuella spontana metastaser. Alla följande procedurer görs i enlighet med institutionella riktlinjer och godkända förfaranden för human användning av försöksdjur. 1. Underhåll av cellinjer Upprätthålla murin renal adenokarcinom cellinje, Renca, i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium kompletterat med 10% fetalt kalvserum …

Representative Results

Den framgångsrika implantation av RENCA-celler resulterar i tumörutveckling i njuren och metastasering till lungorna hos möss. Efter excision av tumörbärande och de kontralaterala njurar, var våta vävnadsvikter (g) mättes för att demonstrera tumörbördan baserat på ökad vikt (Figur 1). Renca-tumörer kan identifieras genom immunhistokemi genom cytokeratin 8 och 18 färgning (figur 2). För longitudinella studier gjordes en luciferas-utt…

Discussion

Vi presenterar ett protokoll för en ortotopisk RCC musmodell. Implantation av mus renala adenokarcinom tumörceller i musens njure ger en kliniskt relevant modell av mRCC. Denna modell resulterar i en primärtumör i njuren och fjärrmetastaser i lungorna, som båda är kännetecken för avancerad RCC. Den beskrivning som presenteras häri är specifikt för Renca-cellinjen hos immunkompetenta Balb / c-möss. Med hjälp av denna ortotopisk modell har vi visat att Renca-tumörer är mottagliga för immunterapi, vilket v…

Materials

Artificial tears ophthalmic ointment	Akorn	NDC 17478-162-35
Vetbond Tissue Adhesive	3M	CBGBIW011019
Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%)	Purdue Products, L.P.	NDC 67618-155-32
0.25% Marcaine (bupivavaine HCL injection)	Hospira	0409-1587-50
Heating pad	Sunbeam
Syringes	BD	309659
Gauze	Venture	908291
Ketamine	Phoenix Pharmaceuticals	NDC 57319-609-02
Xylazine	Akorn	NDC 59399-111
Hank’s Balanced Salts	Sigma-Aldrich	H2387
IVIS	Caliper
D-Luciferin, Potassium Salt	GoldBio	LUCK-1G
India Ink	Chartpak Inc	44201
Scissors
Forceps
Sleeping Beauty (SB) transposon system	Neuromics	SBT0200
Renca	ATCC	CRL-2947