Intracarotid Cancer Cell injektion til Produce musemodeller for hjernemetastaser

Summary

Brain metastaser er blevet en presserende udækket medicinsk behov, da forekomsten er steget, mens behandlingsmuligheder er forblevet palliativ. Oprettelse eksperimentelle dyremodeller for hjernemetastaser via intracarotid arteriel injektion af kræftceller letter mekanistiske undersøgelser af sygdommen biologi og evaluering af nye interven- regimer.

Abstract

Metastase, spredning og vækst af maligne celler ved sekundære steder i en patients krop, udgør> 90% af cancer-relaterede dødsfald. For nylig har imponerende fremskridt i nye behandlingsformer dramatisk forlænget overlevelse og forbedret livskvalitet for mange kræftpatienter. Desværre er forekomsten af ​​hjernen metastatiske gentagelser hurtigt stigende, og alle nuværende terapier er blot palliative. Derfor er et presserende behov for gode eksperimentelle dyremodeller for at lette dybtgående undersøgelser af sygdommen biologi og vurdere nye terapeutiske regimer for præklinisk evaluering. Men et standard in vivo metastase assay via haleveneinjektion af cancerceller producerer overvejende lunge metastatiske læsioner; dyr normalt bukke under for lungerne tumor byrde før nogen meningsfuld udvækst af hjernemetastaser. Intrakardial injektion af tumorceller producerer metastatiske læsioner til flere organsteder herunder hjernen; imidlertid variabiheden af ​​tumorvækst produceret med denne model er stort, afdæmpende dens anvendelighed ved at evaluere terapeutisk effektivitet. At tilvejebringe pålidelige og konsistente dyremodeller for hjernemetastaser undersøgelse her beskriver vi en fremgangsmåde til fremstilling af eksperimentelle hjernemetastaser i huset mus (Mus musculus) via intracarotid injektion af tumorceller. Denne tilgang gør det muligt at producere store antal hjernen metastase-bærende mus med lignende vækst- og dødelighed egenskaber, hvilket letter forskningsindsatsen at studere grundlæggende biologiske mekanismer og vurdere nye terapeutiske midler.

Introduction

Den metastase af kræft til centralnervesystemet (CNS) er en ødelæggende sygdom, og kan involvere enten hjerneparenkymet eller leptomeninges ( "hjernemetastaser" til både i denne artikel). Det er den fremherskende intrakraniel malignitet, outnumbering primære gliomer ved> 10: 1 ^{1, 2.} Lungecancer, brystcancer og melanom er den øverste tre store neoplastiske sygdomme, der producerer høje forekomster af hjernemetastaser ^{3, 4.} I de senere år har imponerende fremskridt i nye kræftbehandlinger dramatisk forlænget overlevelse og forbedret livskvalitet for mange kræftpatienter. Dog ved gentagelse, forekomsten af ​​hjernemetastaser er hastigt stigende. For eksempel har den anti-HER2 antistof trastuzumab (Herceptin) viste signifikant klinisk effekt hos patienter med HER2 + brystkræft; endnu en foruroligende tendens er opståethos disse patienter: op til 1/3 af dem, hvis extrakraniel systemisk sygdom oprindeligt nydt godt af trastuzumab behandling senere udvikle hjernemetastaser ^{5, 6, 7.} Desværre, patienter med hjernemetastaser er refraktære over for næsten alle nuværende behandlinger, som regel oplever en traumatisk forringelse af livskvaliteten, og deres en-års overlevelse efter diagnosen er kun ~ 20% ^8. Aktuelle behandlinger for hjernemetastaser (herunder steroider, kraniel strålebehandling og kirurgisk resektion i udvalgte patienter) er blot palliativ, ikke helbredende ^9. Derfor er hjernen metastaser fremstår som den næste imponerende udfordring i denne tid med nye behandlinger mod kræft. For at imødekomme udækkede udfordring patienter står hver dag i klinikken, vi har hårdt brug for bedre at forstå den underliggende mekanisme af hjernemetastaser og bruge denne viden til at udvikle nye behandlingsformer.

<pclass = "jove_content"> Vellykket kolonisering af hjernen ved metastatiske cancerceller kræver opfyldelse af en række funktioner medieret af den indviklede samspil af flere biologiske aktører som bypass af blodhjernebarrieren (BBB) ​​og flygte fra hjernens iboende immune forsvarsmekanismer ^10, hvoraf ingen er sammenfattet i en ex vivo eller in vitro system. Derfor ordentlig og trofast in vivo modeller er afgørende for studier af hjernen metastaser. En konventionel in vivo metastase assay introducerer cancerceller via haleveneinjektion, fører størstedelen af cellerne til at blive indgivet i lungen. Brain metastatiske læsioner er sjældent produceres i disse modeller, før dyr død forårsaget af tumor byrde i lungerne ^11. Direkte intracerebral injektion af kræftceller producerer konsekvent tumor udvækst i CNS og er meget udbredt i de studier af primære gliomer. Imidlertid such injektion kompromitterer BBB og forårsager traumatisk skade på injektionsstedet, begge vigtige punkter af bekymring for den fysiologiske relevans af denne model. Et andet ofte anvendt cancercelle introduktion rute, intrakardial injektion, er let at administrere og ikke producerer eksperimentel metastase til CNS. Men samtidige metastaser til andre end CNS orgel sites altid produceret og kan forårsage dyr dødelighed ^11; derfor, den høje grad af variabilitet af denne model gør den uhensigtsmæssig til kvantitativ evaluering af biologiske mekanismer eller terapeutiske midler med et begrænset antal dyr.

Her beskriver vi de procedurer til frembringelse eksperimentel hjernemetastaser via injektion af cancerceller i den fælles carotidarterie. Vi har brugt denne metode til at dissekere de enkelte gener bidrag til metastatisk kaskade af hjernemetastaser og vurdere effekten af ​​terapeutisk interventions ^{12, 13.} De store fordele ved denne fremgangsmåde er den høje grad af reproducerbarhed og lav grad af variabilitet; den store ulempe er den sofistikerede og smidighed nødvendig for at udføre mikrokirurgi.

Protocol

Etik erklæring: Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af The University of Texas MD Anderson Cancer Center. 1. Forbered kræftceller til injektion Seed kræftcellerne en eller to dage før injektion. Brug DMEM / F12-medium suppleret med 10% FBS, medmindre en specialitet medium er angivet i litteraturen for en bestemt cellelinie. På dagen for kirurgisk operation, høst cellerne, når de nå op på 70 – med 80% sammenløb ved først at vaske med s…

Representative Results

Der er to punkter, hvor kvaliteten af ​​injektionen kan evalueres. Den første chance er ved operatørens observation af skiftende blodkarrenes farver under injektion. Lækage fra fattige injektioner let kan observeres under dissektionsmikroskop. Den konstante og sikker placering af muse legeme (figur 1A) og dens halspulsåre (figur 1B) på den understøttende vat er kritiske faktorer for smidig og vellykket injektion i carotidarterien. Det andet pun…

Discussion

De mest kritiske trin til vellykket carotis arteriel injektion af cancerceller er: 1) dyb anæstesi af mus i forberedelse til kirurgisk operation; 2) stabil placering af halspulsåren oven på bomuld bærer; 3) stramt ligering af carotidarterien efter vellykket injektion.

Dyb anæstesi på ~ 30 min er normalt nødvendig for stabil kirurgisk ydeevne under dissektionsmikroskop. Vi anvender kommercielt klar til brug ketamin / xylazin cocktail for mus anæstesi. For at undgå potentiel overdosis…

Materials

Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution	Sigma-Aldrich	K113
Routine Stereomicroscope Leica M50	Leica	M50	The microscope is modular and highly configurable to fit particular space requirements.
Surgical disposable scapel	Integra Miltex	4-410	to make skin incisions
Tissue Forceps – 1×2 Teeth	Fine Science Tools	11021-12	to bluntly dissect mucles
Dumont #5 – Mirror Finish Forceps	Fine Science Tools	11252-23	to separate and prepare the carotid artery for injection
Spring Scissors	Fine Science Tools	15025-10	to cut sutures
EZ Clip Kit	Stoelting	59020	for wound cloure
BD Insulin Syringe	Becton Dickinson	328438	for cell injection
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	124262