Analyse Gavnlige virkninger af kosttilskud på Intestinal epitelbarriere funktioner under Eksperimentel Colitis
Summary
Nuværende behandlinger af inflammatoriske tarmsygdomme (IBD) sigter mod at afhjælpe sygdomssymptomer, men kan forårsage alvorlige bivirkninger. Således er alternative strategier, der undersøges i animalske colitis modeller. Her forklarer vi, hvordan de gavnlige virkninger af kosttilskud på kliniske IBD tegn analyseres i et sådant colitis model.
Abstract
Inflammatoriske tarmsygdomme (IBD), herunder Crohns sygdom og ulcerativ colitis, er kronisk tilbagevendende sygdomme i tarmene. De forårsager alvorlige problemer, såsom mavekramper, blodig diarré og vægttab, i berørte individer. Desværre er der ingen kur endnu, og behandlinger kun til formål at lindre symptomerne. Aktuelle behandlinger omfatter anti-inflammatoriske og immunosuppressive lægemidler, der kan forårsage alvorlige bivirkninger. Det forudsætter en søgen efter alternative behandlingsmuligheder, såsom kosttilskud, som ikke forårsager bivirkninger. Før deres anvendelse i kliniske studier, skal sådanne forbindelser være grundigt testet for effektivitet og sikkerhed i dyremodeller. En pålidelig eksperimentel model er den dextransulfat-natrium (DSS) colitis model i mus, som gengiver mange af de kliniske tegn på colitis ulcerosa i mennesker. Vi har for nylig anvendt denne model til at teste de gavnlige virkninger af et kosttilskud indeholdendevitamin C og E, L-arginin, og w3-polyumættede fedtsyrer (PUFA). Vi analyserede forskellige sygdomstilstande parametre og fandt, at dette supplement kunne lindre ødemdannelse, vævsbeskadigelse, leukocytinfiltration, oxidativ stress, og produktionen af pro-inflammatoriske cytokiner, der fører til en generel forbedring af sygdomsaktiviteten indeks. I denne artikel, vi forklare i detaljer den korrekte anvendelse af kosttilskud ved hjælp af DSS colitis modellen i C57BL / 6 mus, samt hvordan sygdom parametre såsom histologi, oxidativ stress, og inflammation vurderes. Analysere de gavnlige virkninger af forskellige kosttilskud kan så i sidste ende åbne nye muligheder for udvikling af alternative behandlingsstrategier, der lindrer IBD symptomer og / eller at forlænge faser remission uden at forårsage alvorlige bivirkninger.
Introduction
Colitis er en inflammatorisk tilstand i tyktarmen som kan forårsage diarré og mavesmerter. Colitis kan være akut som reaktion på infektion eller stress, eller det kan udvikle sig som en kronisk sygdom, såsom i ulcerativ colitis (UC), der tilhører gruppen af inflammatoriske tarmsygdomme (IBD). Skønt de kliniske tegn på UC er blevet godt beskrevet, er patogenesen stadig dårligt forstået 1. Det accepteres blandt eksperter, at UC er en multifaktoriel sygdom, med genetiske mutationer og afvigende immunreaktioner spiller en stor rolle 2. Men miljømæssige faktorer, såsom livsstil og ernæring, også bidrager til sygdommens udvikling og progression 3.
Desværre, IBD er ikke helbredes, men der er mange behandlingsmuligheder, der har til formål at lindre kliniske symptomer. Nuværende behandlinger omfatter anti-inflammatoriske lægemidler, såsom sulfasalazin og kortikosteroider; immunosuppressiva, såsom azathioPrine; monoklonale antistoffer som fanger proinflammatoriske cytokiner, såsom tumornekrosefaktor-α (TNF-α), eller blokere adhæsionsmolekyler, såsom integriner, begrænse overdrevent leukocytrekruttering; og inhibitorer, der er målrettet kinaser, der udløser proinflammatoriske veje, såsom Janus kinase (JAK) 4. Ikke alle patienter reagerer på alle behandlinger, så terapeutiske strategier skal individualiseres 5. Endvidere er de fleste af disse terapeutiske lægemidler interfererer med metabolismen og immunresponser, ofte forårsager alvorlige bivirkninger. Af denne grund har alternative behandlingsmuligheder blevet undersøgt.
Alternative behandlinger omfatter probiotika og kosttilskud, der er anvendt i dyremodeller og kliniske forsøg med varierende grad af succes 6,7. Vi har for nylig fundet, at anvendelsen af forskellige enkelt kosttilskud, såsom anti-oxidative vitaminer eller ω3-poly-umættede fedtsyrer (PUFAs), er ringere end anvendelsen af en kombination af sådanne kosttilskud til lindring colitis og hjerte-kar-sygdom symptomer 8,9. Disse undersøgelser blev udført på mus, så kliniske undersøgelser skal udføres på mennesker for at afgøre, om resultaterne også vil være gældende for mennesker. Før kliniske studier igangsættes, skal effektiviteten og sikkerheden af nye behandlingsmuligheder vurderes i dyremodeller.
For IBD, har dextransulfat-natrium (DSS) model er ofte blevet brugt til at undersøge mekanismerne for sygdomsudvikling og de gavnlige virkninger af lægemidler og kosttilskud 6,10. I de fleste undersøgelser, kun en akut sygdom i løbet af en periode på syv dage er induceret; ikke desto mindre, de kliniske tegn observeret i disse dyr ligner dem observeret i IBD-patienter (dvs. blodig diarré, vægttab, epithelial dysfunktion og immun celleinfiltration) 10. DSS inducerer erosioner i slimhinden,resulterer i barriere dysfunktion og øget intestinal epithelial permeabilitet 11. Den nøjagtige mekanisme stadig ukendt. En undersøgelse tyder på, at DSS interagerer med medium kædelængde fedtsyrer til dannelse nano-lipocomplexes der er i stand til at indtaste epitelceller og fremkalde inflammatoriske signalveje 12. I denne artikel beskriver vi i detaljer, hvordan colitis induceres og analyseret i mus, hvor kosttilskud der anvendes ved tvangsfodring at sikre en konstant dosering i hvert dyr, og hvordan virkningerne af sådanne kosttilskud på forskellige colitis symptomer er undersøgt.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at kunne bruge kosttilskud i kliniske studier, skal fordele og sikkerheden omkring disse tilskud evalueres nøje in vivo i dyreforsøg. I tilfælde af colitis, har flere egnede dyremodeller, der ligner de kliniske tegn på IBD blevet etableret, herunder kemiske modeller med DSS, TNBS eller eddikesyre; knock-out (KO) modeller som IL10-KO; og immun-cellemedieret colitis under anvendelse adoptiv T-celle overdragelse 19-21. The DSS model af colitis er en hurtig og pålidelig metode til at inducere co…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den mexicanske Råd for Videnskab og Teknologi (CONACYT, 207.268 og 233.395 til Michael Schnoor). KFCO er en modtager af en CONACYT stipendium (396.260) for at opnå en MSc grad.
Materials
| 0.3% of gelatin | Bioxon | 158 | |
| 10% formaldehyde | J.T. Baker | 2106-03 | |
| 96-well plate with flat bottom | Corning | 3368 | |
| Absolute ethanol | J.T. Baker | 9000-03 | |
| Absolute xylene | J.T. Baker | 9490-03 | |
| ABTS | Sigma Aldrich | H5882 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| ColoScreen | Helena Laboratories | 5072 | |
| Corabion (Kindly provided by Merck, Naucalpan, Mexico) | Merck | ||
| Dextran Sulfate Sodium Salt | Affymetrix | 9011-18-1 | (M.W. 40,000-50,000) |
| Dihydroethidium | Life Technology | D11347 | |
| Eosin-Y | J.T. Baker | L087-03 | |
| Evans blue | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| Feeding needle | Cadence Science Inc. | 9921 | |
| Glass slide rack with handle | Electron Microscopy | 70312-16 | |
| Glass Slides | Corning | 2947 | |
| Harris hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Hexadecyltrimethyammonium (HTAB) | Sigma Aldrich | H6269 | |
| Histosette (Embedding cassette) | Simport | M498.2 | |
| Hydrochloric acid 1 M | J.T. Baker | 9535-62 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | H3410 | |
| Ketamine | PiSA Agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Liquid paraffin | Paraplast | 39501-006 | |
| Lithium carbonate | Sigma-Aldrich | 2362 | |
| N,N-dimethylformamide | J.T. Baker | 68-12-2 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Plastic cubes | Electron Microscopy | 70181 | |
| Poly-L-Lysine Solution | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | |
| Prism 5 statistical software | GraphPad Software | Prism 5 | |
| Saline Solution 0.9% NaCl | CS PiSA | Q-7833-009 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Synthetic resin | Poly Mont | 7987 | |
| Taq DNA polymerase | Invitrogen | 11615-010 | |
| Tissue-tek. O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tuberculine Syringe | BD Plastipak | 305945 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Xylazine | PiSA Agropecuaria | Q-7833-099 |
Riferimenti
- Souza, H. S., Fiocchi, C. Immunopathogenesis of IBD: current state of the art. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 13-27 (2016).
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448, 427-434 (2007).
- Neuman, M. G., Nanau, R. M. Inflammatory bowel disease: role of diet, microbiota, life style. Transl Res. 160, 29-44 (2011).
- Lowenberg, M., D’Haens, G. Next-Generation Therapeutics for IBD. Current Gastroenterol Rep. 17, 21 (2015).
- Bernstein, C. N. Does everyone with inflammatory bowel disease need to be treated with combination therapy. Curr Opin Gastroenterol. , (2016).
- Nanau, R. M., Neuman, M. G. Nutritional and probiotic supplementation in colitis models. Dig Dis Sci. 57, 2786-2810 (2012).
- Yamamoto, T. Nutrition and diet in inflammatory bowel disease. Curr Opin Gastroenterol. 29, 216-221 (2013).
- Vargas Robles, H., et al. Experimental Colitis Is Attenuated by Cardioprotective Diet Supplementation That Reduces Oxidative Stress, Inflammation, and Mucosal Damage. Ox Med Cell Longev. , 8473242 (2016).
- Vargas-Robles, H., Rios, A., Arellano-Mendoza, M., Escalante, B. A., Schnoor, M. Antioxidative diet supplementation reverses high-fat diet-induced increases of cardiovascular risk factors in mice. Ox Med Cell Longev. 2015, 467471 (2015).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Curr. Protoc. Immunol. 104, 25 (2014).
- Laroui, H., et al. Dextran sodium sulfate (DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in the colon. PLoS One. 7, 32084 (2009).
- Mennigen, R., et al. Probiotic mixture VSL#3 protects the epithelial barrier by maintaining tight junction protein expression and preventing apoptosis in a murine model of colitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, 1140-1149 (2009).
- Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical ‘swiss roll’ method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, 115-120 (1987).
- Shen, W., Gaskins, H. R., McIntosh, M. K. Influence of dietary fat on intestinal microbes, inflammation, barrier function and metabolic outcomes. J Nutr Biochem. , (2013).
- Bruewer, M., et al. Interferon-gamma induces internalization of epithelial tight junction proteins via a macropinocytosis-like process. FASEB J. 19, 923-933 (2005).
- Fournier, B. M., Parkos, C. A. The role of neutrophils during intestinal inflammation. Muc Immunol. 5, 354-366 (2012).
- Yan, Y., et al. Temporal and spatial analysis of clinical and molecular parameters in dextran sodium sulfate induced colitis. PLoS One. 4, 6073 (2009).
- Maxwell, J. R., Viney, J. L. Overview of mouse models of inflammatory bowel disease and their use in drug discovery. Curr Prot Pharmacol, S.J. Enna. , (2009).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, 135-146 (2009).
- Randhawa, P. K., Singh, K., Singh, N., Jaggi, A. S. A review on chemical-induced inflammatory bowel disease models in rodents. Kor J Physiol Pharmacol. 18, 279-288 (2014).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). JoVE. , (2010).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Prot. 2, 541-546 (2007).
- Naydenov, N. G., et al. Nonmuscle Myosin IIA Regulates Intestinal Epithelial Barrier in vivo and Plays a Protective Role During Experimental Colitis. Sci Rep. 6, 24161 (2016).
- Sumagin, R., Robin, A. Z., Nusrat, A., Parkos, C. A. Transmigrated neutrophils in the intestinal lumen engage ICAM-1 to regulate the epithelial barrier and neutrophil recruitment. Muc Immunol. 7, 905-915 (2014).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).
- Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res Notes. 6, 360 (2013).
