attivazione autofagia è utile nella prevenzione di varie malattie. Uno degli approcci fisiologiche per indurre autofagia in vivo è l'esercizio fisico. Qui mostriamo come attivare l'autofagia da esercizi aerobici e misurare i livelli di autofagia nei topi.
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Articolo metodologico
Attivazione di autofagia per esercizio aerobico nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'autofagia è una via di degradazione lisosomiale essenziale per l'omeostasi, la funzione e la differenziazione cellulare. In condizioni di stress, l'autofagia è indotta e prende di mira vari carichi, come citosol di massa, organelli danneggiati e proteine mal ripiegate, per la degradazione nei lisosomi. Le molecole nutritive risultanti vengono riciclate nel citosol per una nuova sintesi proteica e la produzione di ATP. L'upregolazione dell'autofagia ha effetti benefici contro la patogenesi di molte malattie e sono state riportate strategie farmacologiche e fisiologiche per attivare l'autofagia. L'esercizio aerobico è stato recentemente identificato come un efficiente induttore dell'autofagia in più organi nei topi, tra cui muscoli, fegato, cuore e cervello. Qui mostriamo le procedure per indurre l'autofagia in vivo mediante esercizio forzato sul tapis roulant o corsa volontaria sulla ruota. Dimostriamo anche metodi microscopici e biochimici per analizzare quantitativamente i livelli di autofagia nei tessuti di topo, utilizzando le proteine marcatrici LC3 e p62 che vengono trasportate e degradate nei lisosomi insieme agli autofagosomi.
Introduzione
Autofagia è un percorso di degradazione evolutivamente conservato, che viene indotta in risposta a varie condizioni di stress come la fame e ipossia 1, 2. Durante l'autofagia, vescicole a doppia membrana, chiamato autofagosomi, incorporano componenti subcellulari inutili o danneggiati e trasportarli nei lisosomi per la degradazione 3. Autofagia basale è essenziale per la funzione cellulare e lo sviluppo dell'organismo, e alterata autofagia basale è implicato in molti disturbi, tra cui neurodegenerazione, tumorigenesi e diabete di tipo 2 4,
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Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida approvate dal Comitato Northwestern University istituzionale cura degli animali e Usa (IACUC).
1. modelli murini
- Utilizzare 8-12 settimane di età topi nella formazione esercizio. Per rilevare l'autofagia esercitato indotta in vivo, utilizzare il topi transgenici GFP-LC3 (C57BL / 6 di fondo) per studi di imaging e C57BL / 6 topi per le analisi biochimiche.
2. L'autofagia indotta da esercizio
- Messa a punto Treadmill - esercizio forzata
- Acclimatarsi e formare i topi in un 10 ....
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Risultati
Questo protocollo descrive due diversi metodi per indurre l'autofagia nei tessuti di topo di esercizio aerobico: un totale di 90 minuti di esercizio fisico forzato su un tapis roulant a più corsie preceduto da due giorni di acclimatazione; o due settimane di esercizio volontario su una ruota in esecuzione usato dai topi alloggiati individualmente. In ogni protocollo di esercizio, siamo in grado di misurare il flusso autofagia da microscopia a fluorescenza e l'analisi Western Blot.......
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Discussione
Autofagia è un processo catabolico che fornisce energia e riduce citotossicità dalla degradazione lisosomiale di anticitoplasma o organelli danneggiati. Studiare l'autofagia è importante capire la regolazione dell'omeostasi cellulare e meccanismi di risposta allo stress. Nuovi modelli e metodologie stanno emergendo nel campo della ricerca 15, per studiare come alterata autofagia contribuisce a numerosi processi patologici 16, 17. .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Laboratorio di Istologia e Fenotipizzazione del Topo della Northwestern University per il supporto tecnico e l'assistenza, e Noboru Mizushima (Università di Tokyo) per aver fornito topi transgenici GFP-LC3. A. R. e C. H. sono stati supportati dai fondi di avvio della Northwestern University e dalla sovvenzione del National Institutes of Health (DK094980).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tapis roulant | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
| Ruota da corsa del mouse | Super Pet | 100079365 | diametro 11,4 cm |
| Campana del contachilometri | DASHBOARD 100 | ||
| Pompa a siringa | KD Scientific | KDS100 | |
| Microscopio a fluorescenza | Nikon | Modello: microscopio invertito ECLIPSE | |
| Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
| Omogeneizzatore | IKA | 003737001 / Modello: T10 Basic S1 | |
| Clorochina | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
| Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Dispositivi di protezione individuale richiesti. Questo prodotto può rilasciare formaldeide gassosa, una sostanza chimica nota per causare il cancro. |
| Terreni di montaggio | Vector Laboratories | H-1200 | |
| p62 anticorpo | BD Biosciences | 610833 | |
| LC3 anticorpo | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
| ImageJ | NIH |
Riferimenti
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
- Tracy, K., et al.
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Ristampe e permessi
